Введение
Глава 1. Аэробное разложение ароматических соединений грам-отрицательными бактериями 16
2.1.1. Штаммы-деструкторы хлорфенолов 18
2.1.2. Подготовительные этапы разложения моно-полигалогенированных фенолов, фенолгидроксилазы 19
2.1.3. Основные пути разложения (хлор)пирокатехинов 21
2.1.3.1. мета-? асщеш ение пирокатехинов 21
2.1.3.2. opwo-Расщепление (хлор)пирокатехинов 23
2.1.4. Гидроксигидрохиноновый путь расщепления 29
Глава 2. Генетические основы разложения ксенобиотиков микроорганизмами 34
Глава 3. Родококки как биодеструкторы ксенобиотиков 43
3. Методы и материалы 53
3.1. Организмы, методы их культивирования 53
3.2. Клонирование генов 3-ХПК катаболизма у R. opacus lcp 54
3.3. Приготовление бесклеточных экстрактов 55
3.4. Определение активности ферментов 56
3.4.1. Спектрофотометрическое определение активности ферментов 56
3.4.2. Определение активности ферментов методом фтористого ядерно-магнитного резонанса 58
3.5. Анализ образующихся метаболитов методом ВЭЖХ 59
3.6. Анализ образующихся метаболитов методом УФ-спектроскопии 60
3.7. Нативный и SDS-электрофорез 60
3.8. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и аминокислотного состава 61
3.9. Очистка ферментов 61
3.9.1. Очистка ферментов из биомассы штамма R. opacus lcp, выращенной на бензоате 62
3.9.1.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 62
3.9.1.2. Муконатциклоизомераза 62
3.9.2. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 2- хлорфеноле 63
3.9.2.1. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 63
3.9.2.2. Хлормуконатциклоизомераза 63
3.9.2.3. Хлормуконолактондегалогеназа 63
3.9.2.4. Диенлактонгидролаза 64
3*9.3. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus Icp на 4-хлорфеноле. 65
3.9.3.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 65
3.9.3.2. Хлормуконатциклоизомераза 66
3.9.3.3. Диенлактонгидролаза 66
3.9.4. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus Icp на 4-метилбензоате 67
3.9.4.1. Пирокатехин диоксигеназа I 67
3.9.4.2. Пирокатехин диоксигеназа II 68
3.9.4.3. Муконатциклоизомераза 68
3.9.5. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodochrous 89
на феноле. 69
3.9.5.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 69
3.9.5.2. Муконатциклоизомераза 70
3.9.6. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodnii 135 на феноле 71
3.9.6.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 71
3.9.7. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. ruber Р25 на
различных ароматических субстратах. 72
3.9.7.1. Очистка и-гидроксибензоат гидроксилазы 72
3.9.7.2. Очистка протокатехоат диоксигеназы 73
3.9.7.3. Очистка ферментов из биомассы, выращенной на я-толуате 73 3.10.Влияние ЭДТА и я-ХМБ на активность ферментов 74
3.11. Определение кинетических характеристик ферментов 74
3.12. Кристаллизация белков из R. opacus Icp 75 3.12.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 75
3.12.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 75
3.12.3. Рентгено-структурный анализ кристаллов 75
4. Результаты и обсуждение 76
4.1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах 76
4.1.1. Морфологическая диссоциация R. opacus Icp при росте на (хлор)ароматических соединениях 81
4.2. Конверсия фторфенолов родококками 89
4.3. Ферменты обычного орто-путп, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus
Ісрнабензоате 100
4.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 100
4.3.2. Муконатциклоизомераза 102
4.4. Ферменты opmo-пути, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus Icp на 4-
метилбензоате (иора-толуате) 104
4.4.1. пирокатехин 1,2-диоксигеназа I 104
4.4.2. пирокатехин 1,2-диоксигеназа II 107
4.4.3. муконатциклоизомераза 108
4.5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus Icp на 4-хлорфеноле 112
4.5.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 113
4.5.2. Хлормуконатциклоизомераза 118
4.5.3. Диенлактонгидролаза 123
4.6. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus Icp на 2-хлорфеноле 129
4.6.1. 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 132
4.6.2. Хлормуконатциклоизомераза 136
4.6.3. Хлормуконолактондегалогеназа 137
4.6.4. Диенлактонгидролаза 140
4.7. Доказательство функций ферментов 141
4.7.1. Клонирование генов, кодирующих ферменты превращения 3-хлорпирокатехина 141
4.7.2. ВЭЖХ и спектральный анализ превращения 2-хлормуконата С1сВ2, ClcF и ClcD2 146
4.8. Превращение 2-фтормуконатов и фтормуконолактонов 149
4.9. Ферменты штамма R. rhodochrous 89, выращенного на феноле 159
4.9.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 159
4.9.2. Муконатциклоизомераза 160
4.9.3. Превращение 2-хлормуконата 161
4.10. Ферменты штамма R. rhodnii 135, выращенного на феноле 162 4.10.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 162
4.11. Ферменты штамма R. opacus 1G, выращенного на феноле 163 4.11.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 163
4.12. Ферменты разложения ароматических субстратов штамма R. ruber Р25 165
4.12.1. Ферменты разложения 4-хлорбензоата 165
4.12.1.1. шрд-Гидроксибензоат гидроксилаза 165
4.12.1.2. Протокатехоат диоксигеназа 166 4:12.2. Ферменты разложения шра-гидроксибензоата 167 4.12.3. Ферменты разложения 4-метилбензоата (шра-толуата) 167
4.12.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа 168
4.12.3.2. Муконатциклоизомераза 169
4.13. Кристаллизация ферментов 175
4.13.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 175
4.13.2. 3-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 176
4.14. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 178
4.14.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 178
4.14.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 180
4.14.3. Сравнение активных центров диоксигеназ 181
Заключение 192
Выводы 200
Список литературы 202
