Введение
2. Обзор литературы 15
2.1. Введение 15
2.2. Эпидемиология сибирской язвы 16
2.3. Клинические проявления сибирской язвы улюдей 19
2.4. Морфология возбудителя сибирской язвы 20
2.5. Биохимические свойства 22
2.6. Антигенная структура 22
2.7. Патогенность возбудителя сибирской язвы 24
2.8. Токсин 25
2.8.1. Отечный фактор 27
2.8.2. Летальный фактор 28
2.8.3. Протективный антиген 31
2.8.4. Механизм действия сибиреязвенного токсина 32
2.9. Лечение сибиреязвенной инфекции 41
2.10. Противосибиреязвенные вакцины 42
2.10. 1. Живые сибиреязвенные вакцины 42
2.10.2. Химические вакцины 45
2.10.3. Комбинированные вакцины 47
2.10.4. Проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин 48
2.11. Моноклональные антитела- инструменты исследования и препараты медицинского назначения 52
2.11.1. Получение моноклональных антител 55
2.11.2. Свойства моноклональных антител 57
2.11.3. Области применения моноклональных антител 57
3. Материалы и методы 61
3.1. Бактериальные штаммы и генно-инжинерные конструкции 61
3.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. coli 67
3.3. Получение отдельных доменов ПА и ЛФ 67
3.4. Выделение нативных ПА и ЛФ 69
3.5. Получение нетоксичного комплекса (ПА63)7:ЛФн и комплекса (ПА63)7:ЛФ... 71
3.6. Получение антисывороток к олигомеру ПАбЗЛФн 71
3.7. Определение уровня специфичности антител у иммунизированных мышей 72
3.8. Получение гибридом 72
3.8.1. Культивирование миеломной клеточной линии 72
3.8.2. Подготовка макрофагального фидерного слоя 72
3.8.3. Выделение спленоцитов гипериммунных мышей 73
3.8.4. Гибридизация 73
3.8.5. Селекция гибридных клеток 73
3.8.6. Скрининг гибридных клеток - продуцентов mAb 74
3.8.7. Клонирование гибридных клеток 75
3.8.8. Масштабирование гибридом 75
3.8.9. Культивирование гибридом in vivo 75
3.8.10. Криоконсервация 75
3.9. Выделение и очистка моноклональных антител из асцитов 76
3.10.. Определение специфичности МАТ 76
3.11. Определение индекса аддитивности 77
3.12. Оценкатоксин-нейтрализующейактивности invitro 78
3.13. Анализ нейтрализующей активности антител in vivo 79
3.14. Анализ протективной активности отдельных доменов ПА in vivo 79
4. Результаты исследований 80
4.1. Клонирование генов ПА и ЛФ и приготовление конструкций 80
4.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. coli 83
4.3. Продукция и характеристика антигенов возбудителя сибирской язвы 87
4.4. Получение олигомерного комплекса 88
4.5. Иммунизация мышей и получение mAb 89
4.6. Получение и характеристика моноклональных антител к летальному токсину В. anthracis 90
4.6.1. Анализ специфичности моноклональных антител к компонентам сибиреязвенного токсина 91
4.6.2. Определение подклассовой принадлежности 94
4.7. Оценка токсин-нейтрализующей активности на клетках линии J 774 АЛ in vitro 95
4.7.1. Исследования нейтрализации токсина моноклональными антителами против компонента токсического комплекса возбудителя сибирской язвы 97
4.8. Определение доменной специфичности моноклональных антител к сибиреязвенному токсину 102
4.8.1. Идентификация доменов протективного антигена взаимодействующих с моноклональными антителами 102
4.8.2, Идентификация доменов летального фактора взаимодействующих с моноклональными антителами 108
4.9. Исследование роли Fc-фрагмента mAb в усилении токсического эффекта летального токсина на макрофагоп одо бную клеточную линию 112
4.10. Определение сайтов связывания моноклональных антител к протективному антигену В. anthracis 113
4.11. Нейтрализующая активность mAb к протективному антигену in vivo 117
4.12. Исследование протективной активности отдельных доменов ПА .120
4.13. Изучение структуры иммунного ответа у животных,
иммунизированных вакцинным штаммом сибирской язвы СТИ-1 121
5. Обсуждение результатов 122
6. Выводы 130
7. Список литературы 132
