Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Белок Н2АХ - маркер двунитевых разрывов ДНК 13
1.1.1. Характеристика белка Н2АХ 13
1.1.2. Природа спонтанных (фоновых) фокусов H2AX 14
1.2. Образование H2AX при радиационном воздействии 16
1.3. Роль фосфорилирования гистона Н2АХ в репарации двунитевых разрывов ДНК 19
1.3.1. Характеристика киназ, фосфорилирующих H2AX 19
1.3.1.1. Вклад киназ в фосфорилирование Н2АХ 19
1.3.1.2. Особенности пострадиационной активации киназ, фосфорилирующих Н2АХ 21
1.3.2. Основные механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК 23
1.3.3. Влияние структуры хроматина на образование и деградацию радиационно-индуцированных фокусов H2AX 26
1.3.4. Влияние фаз клеточного цикла на образование и деградацию радиационно-индуцированных фокусов H2AX 28
1.4. Возможные причины длительного поддержания «остаточных» радиационно-индуцированных фокусов H2AX 29
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Культура клеток 34
2.1.1. Выделение фибробластов из биоптата кожи в заушной области 34
2.1.2. Подготовка культуры фибробластов к экспериментам 35
2.2. Облучение культуры фибробластов 36
2.3. Проведение иммуноцитохимического анализа 36
2.3.1. Фиксация препаратов 36
2.3.2. Окрашивание препаратов 37
2.3.3. Микроскопия 39
2.3.4. Математический анализ данных 40
Глава 3. Результаты и обсуждение 42
3.1. Изменения количества фокусов Н2АХ в фибробластах человека после воздействия рентгеновского излучения в дозах 20-1000 мГр 42
3.2. Пострадиационное восстановление структуры ДНК от двунитевых разрывов 48
3.2.1. Оценка изменения количества фокусов Н2АХ в фибробластах человека после облучения в дозах 20-1000 мГр 48
3.2.2. Изменения количества и размера фокусов H2AX и фокусов фосфорилированного белка АТМ (рATМ) 52
3.2.2.1. Влияние дозы рентгеновского излучения и времени после облучения на количество фокусов рATМ и их солокализацию с фокусами H2AX 52
3.2.2.2. Влияние дозы рентгеновского излучения и времени после облучения на размер фокусов H2AX и рATМ 58
3.2.3. Влияние дозы рентгеновского излучения и времени после облучения на количество фокусов Rad51 60
3.3. «Остаточные» фокусы Н2AХ, рАТМ и Rad51 через 24 ч после облучения фибробластов. 69
3.3.1. «Остаточные» фокусы Н2AХ 69
3.3.2. «Остаточные» фокусы рАТМ 70
3.3.3. «Остаточные» фокусы Rad51 71
3.4. Влияние пролиферативной активности клеток на эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК 72
3.4.1. Влияние пролиферативной активности фибробластов на изменение количества радиационно-индуцированных фокусов H2AX 73
3.4.2. Влияние малой и средних доз ионизирующего излучения на изменение через 24 ч процентного соотношения клеток в разных фазах клеточного цикла 78
3.4.3. Влияние пролиферативной активности фибробластов на изменение количества радиационно-индуцированных фокусов рАТМ 80
Заключение 82
Выводы 86
Список сокращений 87
Список литературы 90
Приложение а 109
Благодарность 111
