1. ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................. 4
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................... 13
2.1 Классификация повторяющихся элементов генома .................................................................. 13
2.1.1 Тандемные повторы и организация ДНК центромеры ................................................................................. 14
2.1.2 Мобильные элементы растений ..................................................................................................................... 18
2.2 LTR ретротранспозоны растений ............................................................................................... 30
2.2.1 Классификация ............................................................................................................................................... 31
2.2.2 Организация генома LTR ретротранспозона и кодируемые белки .............................................................. 32
2.2.3 Жизненный цикл ............................................................................................................................................. 37
2.3 Ретротранскриптом растений и методы исследования ............................................................. 41
2.3.1 Закономерности организации ретротранскриптома растений ..................................................................... 41
2.3.2 Методы детекции экспрессирующихся ретротранспозонов ........................................................................ 45
2.4 Мобилом растений и методы исследования ............................................................................... 46
2.4.1 Формирование мобилома и его роль в адаптации растений ......................................................................... 46
2.4.2 Arabidopsis thaliana – модельный объект для изучения мобилома ............................................................. 49
2.4.3 Методы детекции новых инсерций мобильных элементов .......................................................................... 50
2.5 Методы идентификации сателлитных повторов растений ....................................................... 52
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................................................. 56
3.1 Растительный материал ............................................................................................................... 56
3.2 Выделение геномной ДНК и приготовление препаратов хромосом ......................................... 57
3.3 Характеристика репитома и идентификация тандемных повторов с помощью коротких
ридов .................................................................................................................................................... 58
3.4 RNAseq анализ транскрипции центромеры Allium. ................................................................... 58
3.5 ПЦР амплификация, клонирование и секвенирование ............................................................. 60
3.6 Приготовление проб для FISH ..................................................................................................... 61
3.7 FISH, GISH и безденатурационная (ND) FISH ........................................................................... 62
3.8 Процедура C-бэндинга/DAPI ....................................................................................................... 63
3.9 Флуоресцентная микроскопия и анализ изображений. ............................................................. 63
3.10 ОТ-ПЦР ....................................................................................................................................... 64
3.11 Нанопоровое секвенирование ДНК ........................................................................................... 65
3.12 Прямое нанопоровое секвенирование РНК (DRS) и сборка транскриптов ........................... 65
3.13 Идентификация экспрессирующихся ретротранспозонов подсолнечника ............................ 66
3.14 Оценка времени инсерции RTE ................................................................................................. 67
3.15 Расчёт расстояния между генами и RTE .................................................................................. 67
3.16 Анализ мобилома по данным Illumina ...................................................................................... 67
3.17 Выделение внехромосомных кольцевых ДНК (вкДНК) .......................................................... 68
3.18 Предсказание длинных некодирующих РНК (днРНК) ........................................................... 69
3.19 Масс-спектрометрический анализ тотального белка .............................................................. 70
3.20 Проверка инсерций МЭ с помощью ПЦР ................................................................................. 71
3.21 Идентификация и отбор LTR ретротранспозонов Aegilops tauschii для CANS ..................... 72
3
3.22 Cas9-опосредованное секвенирование (CANS) ......................................................................... 73
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ....................................................................................... 74
4.1 Цитогеномный анализ новых сателлитных повторов растений ............................................... 74
4.1.1 pyTanFinder: инструмент для поиска высококопийных тандемных повторов в секвенированных геномах
................................................................................................................................................................................... 74
4.1.2 nanoTRF: программа для поиска высококопийных тандемных повторов в «сырых» данных нанопорового
секвенирования ......................................................................................................................................................... 74
4.1.3 DRAWID: java программа для измерения параметров хромосом и построение идиограмм хромосом .... 79
4.1.4 Тандемные повторы Allium fistulosum, ассоциированные с центромерными и гетерохроматиновыми
регионами хромосом ................................................................................................................................................ 88
4.1.5 Молекулярно-цитогенетическая характеристика функциональной центромеры A. fistulosum ................ 97
4.1.6 Идентификация тандемных повторов Rosa wichurana и Rosa chinensis для цитогенетического
маркирования хромосом и аннотации генома ...................................................................................................... 113
4.1.7 Анализ тандемных повторов в геноме мха, Physcomitrella patens ............................................................. 120
4.2 Транскриптомные особенности ретротранспозонов растений ............................................... 134
4.2.1 Десятки LTR ретротранспозонов экспрессируются в геноме подсолнечника (Helianthus annuus) ........ 134
4.2.2 Экспрессия LTR ретротранспозонов подсолнечника под действием эпигенетического стресса ............ 148
4.2.3 Ретротранскриптом развивающейся зерновки тритикале .......................................................................... 155
4.3 Активные мобильные элементы растений и особенности их инсерций в геноме .................. 163
4.3.1 nanotei: программа для идентификации нереференсных инсерций транспозонов по данным
полногеномного нанопорового секвенирования .................................................................................................. 163
4.3.2 CANS: Cas9-опосредованное обогащение библиотек для нанопорового секвенирования инсерций
транспозонов растений ........................................................................................................................................ 172
4.3.3 NanoCasTE: программа для идентификации нереференсных инсерций транспозонов по данным CANS
................................................................................................................................................................................. 178
4.3.4 Геномная организация инсерций LTR ретротранспозона EVD в геноме ddm1 ........................................ 179
4.3.5 Инсерционный ландшафт ретротранспозона ONSEN, полученный с помощью CANS .......................... 185
4.3.6 Инсерции элементов ONSEN преимущественно возникают в генах с пониженной экспрессией в ответ на
тепловой стресс ...................................................................................................................................................... 188
4.3.7 Мобильная активность экспрессирующихся ретротранспозонов подсолнечника ................................... 191
4.3.8 Новый Ty1/Сopia LTR ретротранспозон MIG активен в развивающейся зерновке тритикале. ............. 197
4.3.9 Ретротранспозоны и эволюция размера генома Fagopyrum tataricum и F. esculentum ............................ 199
4.4 Структура и состав внехромосомных кольцевых ДНК (вкДНК) LTR ретротранспозонов
растений ............................................................................................................................................ 203
4.4.1 Особенности вкДНК A. thaliana, выявленные с помощью нанопорового секвенирования ..................... 205
4.4.2 Нанопоровое секвенирование вкДНК рапса (Brassica napus) выявило новое семейство активных LTR ретротранспозонов ANTARES. ............................................................................................................................. 212
4.5 Мобильные элементы и протеом растений .............................................................................. 218
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................... 222
6. ВЫВОДЫ ............................................................................................................................ 225
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................. 227
8. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ................................................................................................. 230
8.1 Публикации по теме диссертации ............................................................................................. 230
8.2 Другие публикации в международных рецензируемых журналах ......................................... 231
9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................... 233
