Введение
II. Обзор литературы: белки клеточной стенки дрожжей и способы их закрепления 9
Введение 9
1. Компоненты клеточной стенки дрожжей 10
2. Способы ковалентной модификации белков клеточной стенки 13
2.1.1Ч-гликозилирование 13
2.2.0-гликозилирование 14
2.3. GPI-якорь 15
3. Классификация и характеристика белков клеточной стенки по способу экстракции. 15
3.1. Ковалентно закрепленные белки: GPInPIR 16
3.1.1. GPI-белки клеточной стенки 17
3.1.2. ASL-белки клеточной стенки 24
3.2. SEP-белки клеточной стенки 26
3.2.1. Глкжантрансфераза Bgl2p клеточной стенки дрожжей. 33
4. Примеры белков, ремоделирующих клеточную стенку дрожжей 38
4.1. р-1,3-глюканозилтрансферазаОа5Ір 39
4.2. Экзо-р-1,3-глюканазы 39
4.3. Эндохитиназа 40
4.4. Предполагаемые глюкан/хитин кросс-связывающие ферменты 40
4.5. Глюканазы Scw4p и ScwlOp 41
4.6. Глкжантрансфераза Bgl2p 41
5. Заключение 44
III. Материалы и методы 45
1. Используемые в работе реактивы 45
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания 45
3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов 46
4. Трансформация клеток дрожжей 46
5. Выделение суммарной ДНК дрожжей 46
6. Электрофоретические методы 47
6.1 Электрофорез ДНК в агарозном геле 47
6.2 Электрофорез белков в денатурирующих условиях 47
7. Вестерн-блот анализ 48
8. Окраска белков при помощи Кумасси 48
9. Окраска белков при помощи нитрата серебра 48
10. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения 49
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 50
12. Выделение клеточных стенок дрожжей 50
13. Частичная депротеинизация клеточных стенок 51
14. Экстракция белков клеточных стенок дрожжей 51
15. Выделение глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей 52
16. Спектроскопия кругового дихроизма 52
17. Приготовление тотальных препаратов внутриклеточных белков 53
18. Приготовление препарата Bgl2p для MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа 53
18.1. Трипсинолиз белка в ПААГ 53
18.2. Фракционирование пептидов, полученных в результате обработки белка трипсином 54
19. MALDI-TOF масс-спектрометрия 55
20. Микроскопические методы анализа 55
20.1 Конфокальная микроскопия препаратов, окрашенных антителами и дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия клеточных стенок дрожжей 55
20.2 Электронная микроскопия фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы Bgl2p 56
21. Связывание флуоресцентного красителя Thioflavin Т (ThT) 56
22. Собственная флуоресценция глюкантрансферазы Bgl2p 57
23. Тушение собственной флуоресценции Bgl2p 57
24. Прочие методы 58
IV. Результаты и обсуждение 59
1. Сравнение BgI2p, закрепляющегося в клеточной стенке, и Bgl2p, секретируемого в среду культивирования дрожжей S. cerevisiae 59
1.1. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae а-типа спаривания 61
1.2. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из среды культивирования дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4 62
1.3. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточной стенки штамма S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа 62
1.4. Масс-спектрометрический анализ глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания 64
1.5. Обобщение результатов масс-спектрометрического анализа Bgl2p. Поиск различий в N-гликозилировании Bgl2p из клеточной стенки и среды культивирования 65
2. Формирование ассоциатов Bgl2p фибриллярной морфологии в препарате из среды культивирования штамма S. cerevisiae А270 с нарушенным геном SSU21/MCD4 68
3. Характеристика роли дисульфидных связей для закрепления глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок 75
4. Получение мутантов А- и а-типов спаривания с нарушенным геном BGL2 из дрожжей Cerevisiae дикого типа 76
5.Фенотипическое проявление делеции гена BGL2 на дрожжах S. cerevisiae А- и а- типов спаривания 77
6. Изучение конформационных особенностей Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae дикого типа 79
6.1. Температурно-зависимые конформационные переходы Bgl2p 79
6.2.Измерение констант тушения собственной флуоресценции триптофановых остатков Bgl2 хлоридом цезия, йодидом калия и акриламидом 83
6.2.1 .Константы тушения хлоридом цезия. 83
6.2.2.Константы тушения йодидом калия. 86
6.2.3 .Константы тушения акриламидом 88
6.2.4.Общая характеристика данных по константам тушения хлорида цезия, иодида калия и акриламида при разных температурах 90
6.3. Дополнительное подтверждение уменьшения эспонированности остатков триптофана Bgl2p при повышении температуры 92
6.4. Влияние рН среды и ионов двухвалентных металлов на значение параметра А 95
6.5. Расчет параметра а-меры завершенности перехода из одного состояния молекулы в другое состояние 95
7. Заключение 98
V. Выводы 99
Приложение 1 .Компьютерный расчет масс пептидов Bgl2p, возникающих в результате гидролиза трипсином. Массы пептидов располагаются в порядке нахождения пептидов в последовательности белка 100
Приложение 2. Компьютерный расчет масс пептидов Bgl2p, возникающих в результате гидролиза трипсином. Массы пептидов располагаются по величине в порядке убывания 105
Приложение 3 Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания 110
Приложение 4. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 112
Приложение. 5. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из среды культивирования штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4 114
Приложение 6. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из среды культивирования штамма дрожисей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4 вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 117
Приложение 7. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточной стенки штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа 119
Приложение 8. Соответствие значений детектированных масс при масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата BgI2p из клеточной стенки штамма дрожжей S.cerevisiae а-типа спаривания с нарушенным геном SSU21/MCD4, несущего на плазмиде ген SSU21/MCD4 дикого типа, вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 122
Приложение 9. Идентифицированные значения масс и интенсивности пиков при повторном масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания 124
Приложение 10. Соответствие значений детектированных масс при повторном масс-спектрометрическом анализе трипсинового гидролизата Bgl2p из клеточных стенок дрожжей S.cerevisiae А-типа спаривания вычисленным значениям масс пептидов, которые должны получиться в результате гидролиза Bgl2p трипсином 126
VI. Ссылки 129
