Введение
3 Обзор литературы 1 О
3.1 Ингибиторы синтеза белка 10
3.1.1 Высокомолекулярные ингибиторы синтеза белка 1 0
3.1.1.1 Рицин 11
3.1.1.2 Вискумин 21
3.1.1.3 Внутриклеточный транспорт белковых токсинов 25
3.1.1.4 Транслокация токсинов 29
3.1.2 Низкомолекулярные ингибиторы синтеза белка 3 1
3.1.2.1 Циклогексимид 33
3.1.2.2 Различные пути гибели клетки 34
3.1.3 Действие РИБ2, отличное от ингибирования синтеза белка 46
4 Материалы и методы 48
4.1 Материалы 48
4.2 Клеточные линии 4 8
4.3 Очистка моноклональных антител 48
4.4 Проведение электрофореза 49
4.5 Системы ТИФА 50
4.5.1 Твердофазный иммуноферментный анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами 50
4.5.2 Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина 50
4.5.3 Определение концентрации R60 и RTA в лизатах клеток, предобработанных R60 51
4.6 Биотипилирование белков 5 1
4.7 Получение конъюгатов белков с флуорохромами 52
4.8 Оценка цитотоксических свойств ИСБ 53
4.8.1 МТТ-тест 53
4.8.2 SRB-тест 53
4.9 Приготовление 4,5% параформальдегида 54
4.10 Анализ митогенной активнос ИСБ 54
4.11 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу 54
4.12 Исследование кинетики выхода вискумина из полилактидной матрицы 55
4.13 Анализ количества вискумина, высвободившегося при деградации полилактида 56
4.14 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 56
5 Результаты и обсуждение 58
5.1 Выявление свободной RTA в клетках, предобработанных рицином 58
5.1.1 Тест-система для выявления свободной RTA в клетке 60
5.1.2 Определение свободной каталитической субъедипицы рицина в клетках, предобработанных R60 63
5.1.3 Накопление свободной RTA в клетках, предобработанных рицином 66
5.1.4 Характеризация компартмента, содержащего свободную RTA 68
5.1.4.1 Совместное распределение RTA с рицином 69
5.1.4.2 Совместное распределение RTA с эндоплазматическим рстикулумом 74
5.1.4.3 Совместное распределение с аппаратом Гольджи 77
5.1.5 Объём компартмента, содержащего рицин 78
5.2 Влияния РИБ, непосредственно не связанные с ингибированием синтеза белка 82
5.2.1 Митогенное действие рибосом-инактивирующих белков 2 типа Подбор митостатика и его концентраций 84
5.2.1.1 Влияние времени инкубации с митостатиком на митотический и апоптотический индексы 87
5.2.1.2 Митогенная активность ингибиторов синтеза белка 88
5.3 Апоптотические изменения под действием токсинов 92
5.3.1 Выявление экспозиции фосфатидилсерина во внешнем слое плазматической мембраны с помощью Annexin V 92
5.3.2 Анализ фрагментации ДНК 96
5.3.2.1 Анализ деградации ДНК с помощью электрофоретического разделения в агарозном геле 96
5.3.2.2 Количественный анализ фрагментации ДНК методом проточной цитофлуориметрии 98
5.3.3 Анализ фрагментации ядер 100
5.4 Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу 102
6 Выводы 1 1 1
7 Благодарности 112
8 Список литературы
