Введение
ГЛАВА 2. Обзор литературы
2.1. Общая характеристика фенотипа трансформированных клеток 7
2.2. Аденовирусный онкоген Е1А: структура и клеточные функции 14
2.2.1. Мишени белка El А - регуляторы клеточного цикла 18
2.2.2. Е1А в регуляции транскрипции на уровне модуляции активности хроматина 21
2.2.3. Транскрипционный фактор API как мишень онкобелка Е1А 22
2.2.4. Цитоплазматические мишени El А 24
2.2.5. Е1А как «опухолевый супрессор» 26
2.2.6. Индукция апоптоза белком Е1А: секвестрирование р53 27
2.3. Клеточные функции белка Е1В-19кДа 29
2.4. Функции белка Ras в проведении сигнала и трансформации клеток...32
2.5. Регуляция клеточного цикла 36
2.5.1. Комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами как ключевые регуляторы прохождения клетки по циклу 38
2.5.2. Белки семейства ретинобластомы - негативные регуляторы перехода G1/S 50
2.6. Транскрипционный фактор API 54
2.6.1. Структура и регуляция активности cJun 55
2.6.2. cJun в пролиферации 58
2.6.3. cJun в трансформации и опухолевой прогрессии клеток 59
2.6.4. cJun как регулятор апоптоза 60
2.7. Стресс киназы семейства JNK 62
2.7.1. Регуляция активности киназ JNK 63
2.7.2. JNK как регулятор транскрипционного фактора API 66
2.7.3. Роль JNK в пролиферации и опухолевой прогрессии. 67
2.8. Малые ГТФазы семейства Rho 68
2.8.1. Роль Rho ГТФаз в реорганизации цитоскелета и трансформации клеток 71
2.8.2. Роль белков Rho в регуляции транскрипции генов и пролиферации 73
ГЛАВА 3. Материал и методы
3.1. Клеточные линии и их культивирование, получение стабильных трансформантов, временные трансфекции 74
3.2. Анализ клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии.. 75
3.3. Конструирование плазмид 75
3.4. Иммуноблотинг и иммунопреципитация 76
3.5. Анализ киназной активности in vitro 77
3.6. Метаболическое мечение 77
3.7. Оценка люциферазной активности для тестирования активации JNK/cJun пути 78
3.8. Оценка роста клеток в полужидком агаре 79
3.9. Оценка апоптотической гибели клеток методом фрагментации ДНК..79
3.10. Кривая роста 80
3.11. Ядерно-цитоплазматическое фракционирование клеток 80
3.12. Оценка активности малой ГТФазы Cdc42 81
ГЛАВА 4. Результаты
4.1. Влияние онкобелка Е1А на активность JNK/cJun пути 81
4.1.1. Описание эстрадиол-индуцибельных ДНК-конструкций, кодирующих онкобелок El А 82
4.1.2. Е1А временно активирует киназу JNK 84
4.1.3. Е1А активирует транскрипционный фактор cJun за счет активации киназы JNK 86
4.1.4. Е1А активирует киназу JNK в цитоплазме 88
4.1.5. Активация JNK/cJun пути онкобелком Е1А опосредована активацией Cdc42->MEKK1->MKK4,7 сигнального каскада 92
4.1.6. Анализ функционирования JNK/cJun пути у El А- экспрессирующих трансформантов 95
4.2. Исследование способности Е1А-экспрессирующих трансформантов регулировать прохождение по клеточному циклу 101
4.2.1. Характеристика Е1 А-экспрессирующих трансформантов 101
4.2.2. Анализ содержания циклинов и киназ Gl-фазы и формирование их комплексов после облучения 109
4.2.3. Анализ функционирования ингибитора p21/Wafl у Е1А-экспрессирующих трансформантов после облучения 112
4.2.4. Анализ активности циклин-зависимых киназ после облучения 116
4.2.5. Роль фосфорилирования в регуляции функционирования циклин-зависимых киназ у Е1 А-трансформантов 118
4.2.6. Состояние фосфорилирования белков семейства pRb у El А- трансформантов 122
ГЛВАВА 5. Обсуждение результатов 125
Заключение 152
Выводы 154
Список работ, опубликованных по теме диссертации 155
Список цитированной литературы 157
