Введение
Глава 1. Механизм РНК-интерференции и перспективы применения
интерферирующих РНК в биомедицине {обзор литературы) 9
1.1 Механизм РНК-интерференции 9
1.1.1 Фаза инициации 11
1.1.1.1 Белок Дайсер 11
1.1.1.2 Процессинг дцРНК 11
1.1.1.3 Влияние структуры дцРНК на эффективность ее расщепления белком Дайсер 1.1.2 Эффекторная фаза 13
1.1.2.1 Сборка комплекса RLC 14
1.1.2.2 Белок Адо2 15
1.1.2.3 Сборка комплекса RISC 16
1Л.2.4 Расщепление мРИК-мишени 19
1.1.3 Особенности протекания РНКи у различных организмов 20
1.2 Свойства и структура siPHK 22
1.2.1 Нуклеотидный состав siPHK... 23
1.2.1.1 Влияние мисматчей на эффективность действия siPHK. 24
1.2.2 Термодинамические параметры дуплекса 24
1.2.3 Влияние вторичной структуры мРНК-мишени на активность siPHK 26
1.2.4 Влияние длины зіРНКна её активность 27
1.2.5 Химически модифицированные siPHK 27
1.2.5.1 Влияние химических модификаций З-и 5- концов зіРНКна ее
биологическую активность 28
1.2.5.2 Влияние химических модификаций нуклвотидов и фосфатных группе составе э/РНКна ее биологическую активность 41
Модификация фосфата 41
Модификации рибозы 41
Модификации азотистых оснований 44
1.2.6 Специфичность действия siPHK 45
1.2.6.1 Индукция интерферонового ответа 46
1.2.6.2 Действие siPHK на экспрессию частично гомологичных генов 47
1.2.6.3 Конкуренция siPHK за компоненты комплекса RISC 48
1.3 Использование siPHK in vivo 48
1.3.1 Локальное применение 50
1.3.2 Системное применение 51
1.3.2.1 Гидродинамическая доставка 51
1.3.2.2 Рецептор- опосредованная доставка 52
1.4 Испытание siPHK на мышиных моделях заболеваний человека 53
1.4.1 Воспалительные заболевания 55
1.4.2 Онкологические заболевания 55
1.5 Заключение 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы 59
2.1 Материалы 59
2.1.1 Реактивы, препараты и оборудование 59
2.1.2 Линии клеток 59
2.1.3 Оли гону клеотиды 59
2.1.4 Буферы и растворы, использованные в работе 60
2.2 Методы 61
2.2.1 Электрофорез 61
2.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле 61
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 61
2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в нашивных условиях 62
2.2.2 Введение [32Р]-метки в 5-концевое положение олигорибонуклеотидов
2.2.3 Введение остатка флуоресцеина в З-концевое положение антисмысловои qennsiPHK 62
2.2.4 Гибридизация олигорибонуклеотидов (образование siPHK дуплекса) 63
2.2.5 Частичный гидролиз олигорибонуклеотида в денатурирующих условиях... 63
2.2.5.1 Статистическое расщепление олигорибонуклеотида 2 М имидазолом 63
2.2.5.2 Расщепление олигорибонуклеотида РНКазой Т1 в денатурирующих условиях 63
2.2.6 Исследование нуклеазоустойчивости siPHK в среде IMDM, содержащей 5%-нуюРВЭ 64
2.2.7 Исследование эффективности проникновения siPHK Е в клетки линии КВ-8 64
2.2.7.1 Трансфекция клеток siPHK. 64
2.2.7.2 Оценка проникновения siPHK в клетки 64
2.2.3 Выделение суммарной клеточной РНК 65
2.2.9 Измерение уровня экспрессии определенных генов в культивируемых
клетках методом ОТ-ПЦР 65
2.2.9.1 Обратная транскрипция 65
2.2.9.2 ПЦР 66
2.2.10 Определение чувствительности клеток к винбластину (МТТтест) 67
2.2.11 Измерение функциональной активности Р-гликопрстеина 67
2.2.12 Вестерн-блот анализ (определение количества белка Р-гликопротеина)„67
Глава 3. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с
помощью малых интерферирующих РНК (Результаты и обсуждение) 69
3.1 Выбор мишени 69
3.2 Характеристика использованных линий клеток 71
3.3 Исследование ингибирования экспрессии гена MDR1 под действием siPHK 73
3.3.1 Анализ проникновения siPHK в клетки КВ-8-5 в присутствии и отсутствие трансфецирующего реагента Олигофектамина 74
3.3.2 Влияние siPHK на уровень мРНК гена MDR1 76
3.3.3 Восстановление чувствительности клеток к цитостатикам под действием siPHK 77
3.4 Анализ специфичности действия используемых siPHK 79
3.5 Влияние выбора мишени в составе мРНК гена MDR1 на эффективность
подавления экспрессии этого гена под действием siPHK 83
3.5.1 Восстановление чувствительности клеток к винбластину под действием siPHK, направленных к различным участкам мРНКгена MDR1 83
3.5.2 Действие siPHK на клетки КВ-3-1 и КВ-8-5 при культивировании без винбластина 85
3.5.3. Влияние анти-MDR siPHK на уровень Р-гликопротеина 85
3.5.4 Влияние использования различных siPHK на функциональную активность Р-
гликопротеина 36
3.6. Химические модификации . ...91
3.6.1. Использованные химические модификации 91
3.6.2. Исследование сохранности SIPHKB культуральной среде 91
3.6.3. Биологическая активность siPHK и ее химически модифицированных
аналогов 96
3.6.3.1 Влияние на биологическую активность siPHK содержания в ее составе
полностью 2-0 метилированных цепей 96
3.6.3.2 Влияние на биологическую активность полностью 2-0~ метилированной siPHK З-З инверсии 98
3.6.3.3 Влияние на проявление биологической активности siPHK цепей, содержащих 2-0- метильных звена на 3- выступающих концах, и З-З инверсию99
3.7. Продолжительность ингибирующего действия 99
3.8. Восстановление чувствительности клеток к сниженной концентрации винбластина под действием siPHK. 100
Выводы 105
Список литературы 106
