ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОКСОКРАЩЕНИЙ,ИСПОЛЬЗОВАННЫХВРАБОТЕ...........................5
ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................6
Актуальностьтемыисследования.............................................................................6
Цельработы................................................................................................................7
Задачиисследования..................................................................................................8
Положения,выносимыеназащиту...........................................................................8
Научнаяновизна.........................................................................................................8
Теоретическаяипрактическаязначимостьработы.................................................9
Личныйвкладавтора................................................................................................10
Апробацияработы....................................................................................................10
Финансоваяподдержкаработы...............................................................................11
Объемиструктурадиссертации..............................................................................11
СПИСОКПУБЛИКАЦИЙПОТЕМЕДИССЕРТАЦИОННОЙРАБОТЫ.....12
1.ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................14
1.1.РепарацияДНК.....................................................................................................14
1.4.1.ПовреждениеДНК..........................................................................................14
1.4.2.РаспознаваниеповрежденияДНК................................................................16
1.4.3.Репарациядвунитевыхразрывов..................................................................18
1.4.4.ИнгибиторыHDACирепарацияДНК.........................................................22
1.2.Ингибиторыгистоновыхдацетилаз(ингибиторыHDAC)...........................23
1.2.1.Ацетилированиекакэпигенетическаярегуляция........................................23
1.2.2.Разнообразиеингибиторовгистоновыхдеацетилаз....................................24
1.2.3.АнтипролиферативныйэффектингибиторовHDAC..................................26
1.3.Онкогеннаятрансформацияиопухолевыеклеточныелинии....................27
1.3.1.Моделированиевисследованиизлокачественныхновообразований.......27
1.3.2.Аденовируснаятрансформация....................................................................28
1.3.3.Онкогенысемействаras.................................................................................29
1.4.Передачасигналавклетке.................................................................................30
1.4.1.Семействомитоген-активируемыхкиназ.....................................................30
1.4.2.MAPKиответнаповреждениеДНК............................................................31
1.5.Активацияапоптоза.............................................................................................33
1.5.1.Внешнийивнутреннийпутиактивации......................................................33
1.5.2.БелкисемействаBcl-2....................................................................................34
1.5.3.Ингибированиепермеабилизациимембранымитохондрии......................36
3
2.МАТЕРИАЛЫИМЕТОДЫ...................................................................................38
2.1Клеточныелинииивоздействия..................................................................38
2.2ОценкажизнеспособностиклетокприпомощиМТТ-теста.....................39
2.3Анализвзаимодействиялекарственныхпрепаратовinvitro.....................40
2.4Клоногенныйанализ.....................................................................................40
2.5ВыявлениемаркерастаренияSAβ-Gal.......................................................40
2.6Распределениеклетокпофазамклеточногоцикла....................................41
2.7Измерениемитохондриальногомембранногопотенциала(Ψm)..............41
2.8Иммуноблоттингбелков...............................................................................42
2.9Иммунопреципитациябелков......................................................................43
2.10.Иммунофлуоресценция..............................................................................43
2.11Реактивациятранскрипции(Hostcellreactivationassay).........................44
2.12АнализфрагментацииДНК........................................................................45
2.13Нейтральныйметодкомет..........................................................................46
2.14ВыделениетотальнойРНК,обратнаятранскрипцияиПЦРвреальном
времени.................................................................................................................47
2.15.Использованноепрограммноеобеспечение(ПО)...................................48
3.ОСНОВНЫЕРЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЯ.............................................49
3.1.Ингибиторыгистоновыхдеацетилазоказываютантипролиферативный
эффектнаопухолевыеионкоген-трансформированныеклетки.......................49
3.2.Ингибиторыгистоновыхдеацетилазповышаютчувствительность
опухолевыхионкоген-трансформированныхклетоккдействию
генотоксическихагентов,активируяапоптозповнутреннемупути................53
3.2.1.Бутиратнатрияусиливаетантипролиферативныйэффектэтопозидав
онкоген-трансформированныхклетках..................................................................53
3.2.2.Бутиратнатрияувеличиваетчувствительностьопухолевыхклеточных
линийчеловекакнизкимконцентрациямэтопозида............................................56
3.2.3.ИнгибиторHDACусиливаетапоптоз,вызываемыйэтопозидомпо
внутреннемупутиактивации,зависимомуотмитохондрии................................59
3.2.4.ИнгибиторHDACбутиратнатрияизменяетсодержание
белков-регулятороввнутреннегопутиактивацииапоптоза.................................63
3.2.5.Ингибиторгистоновыхдеацетилазбутиратнатрияусиливает
антипролиферативныйпотенциалэтопозидавбольшейстепени,чемколцемида
вE1A+Ras-трансформированныхклетках.............................................................71
3.3.ИнгибиторыгистоновыхдеацетилаззатрудняютрепарациюДНКв
онкоген-трансформированныхклетках,действуянабелки,удерживающие
концыДНК-разрывов.................................................................................................74
3.3.1.ИнгибиторHDACбутиратнатрияпродлеваетприсутствиев
4
трансформированныхклеткахфокусовфосфорилированногогистонаH2AX,
индуцированныхдоксорубицином.........................................................................74
3.3.2.ИнгибиторHDACбутиратнатрияпродлеваетжизньдвунитевых
разрывовДНК,вызванныхгенотоксическимвоздействиемв
E1A+Ras-трансформированных,ноневнормальныхклетках............................76
3.3.3.ИнгибиторHDACбутиратнатрияподавляетрепарациюэкзогеннойДНК
вонкоген-трансформированных,ноневнормальныхклетках...........................79
3.3.4.ИнгибиторHDACбутиратнатриямодулируетработубелков,
удерживающихконцыразрывовДНКвтрансформированныхклетках.............81
3.4.ИнгибиторHDACбутиратнатриямодулируетактивностьфосфатазчерез
активациюMAPKp38................................................................................................89
4.ОБСУЖДЕНИЕРЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................................92
ИнгибиторыHDACсенсибилизируютопухолевыеклеткикэтопозиду,создавая
предпосылкикусилениюантипролиферативноговоздействия..........................92
ИнгибиторыгистоновыхдеацетилаззатрудняютрепарациюДНКв
онкоген-трансформированныхклетках,действуянабелки,удерживающие
концыДНК-разрывов...............................................................................................98
РегуляцияпосттрансляционныхмодификацийбелкаMre11.............................102
ВлияниеингибитораHDACнабелокMre11опосредуетсякиназойp38..........106
5.ВЫВОДЫ.................................................................................................................109
6.ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................110
СПИСОКИСПОЛЬЗОВАННОЙЛИТЕРАТУРЫ...............................................114
БЛАГОДАРНОСТИ...................................................................................................125
