Введение
I. Значение фитаз для кормопроизводства 9
II. Источники ФИТАЗ 10
2.1. Скрининг фитаз у микроорганизмов 10
2.2. Фитазы грибного происхождения 11
2.2.1. Фитаза PhyA Asprergillus niger 13
2.2.2. Фитазы из A terreus и базидиошщетов 13
2.2.3. Термостабильная фитаза Aspergillus jutnigatus 14
2.2.4. Дрожжевые фитазы 15
2.3. Бактериальные фитазы 15
23.1. Фитаза АррА Е. сой 16
2.3.2. Фитазы бактерий родов Klebsiella Я Citrobacter 17
2.3.3. Фитазы бацилл 18
3. Филогенетическая классификация фитаз 19
4. Различные механизмы действия фитаз из разных белковых семейств 21
4.1. Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз. 21
4.2. Бациллярные щелочные фитазы 24
4.3. Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз. 25
5. Биохимические свойства фитаз и их пгомышленно важные характеристики 26
6. Изменение свойств белков при помощи методов белковой инженерии 31
6.1. Принципы рационального конструирования белков, 31
6.2. Методы «направленной эволюции» 33
6.3. Концепция «консенсусний» последовательности 34
6.4. ИзменениерН профиля белков 37
7. Экспрессия фитаз в различных системах 39
7. /, Экспрессия фитаз в бактериях 39
7.2. Экспрессия фитаз в дрожжах 40
7.3. Экспрессия фитаз в грибах , 41
III. Материалы и методы . . 43
1. Средни условия культивирования 43
2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 43
3. Приготовление образцов фитаз 47
4. Свойства ферментов 48
5. Конструирование штаммов К coll с делецией аррА 49
6. Гибридизация ДНК с радиоактивным зондом и изоляция фрагмента ДНК, содержащего ген phyX, гомологичный гену аррА 49
7. Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность 50
8. Конструирование геномной библиотека и отбор клонов с искомой вставкой 51
9. Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз 51
10. Определение N-концевой аминокислотной последовательности белка 52
11. Анализ аминокислотных последовательностей 53
IV. Результаты и обсуждение .54
1. Поиск новых фитаз, продуцируемых бактериями 54
1.1. Поиск секретируемых фитаз бактерий 54
1.1.1. Поиск фитаз у природных изолятов 54
1.1.2. Поиск фитаз у коллекционных штаммов 55
1.2. Поиск внутриклеточных фитаз у грамотрицательных бактерий 56
1.2.1. Поиск внутриклеточных фитаз у ксллекциошшх штаммов , 56
1.2.2. Исследование фитаз у представителей природных популяций Е. coli 57
2. Клонигование гена phyx, имеющего сходство с арра е. coli, но кодирующего фермент С
неизвестной функцией 59
2.1. Поиск генов, гомологичных аррА у бактерий синтезирующих внутриклеточные фитазы 59
2.1.1. Поиск гомологичных генов с использованием ГЩР 59
2.1.2. Поиск гомологичных генов с использованием метода гибридизации 59
2.1.3. Рестрикционного анализ фрагмента хромосомы О. protem В5477, содержащих phyX 60
2.1.4. Исследование других штаммов О. proieus на наличие гена phyX 61
2.3. Изоляция и секвенирование фрагмента из хромосомы О. proteus, содержащего ген phyX. 62
2.3.1 Создание мутанта с полной делецией в хромосоме гена аррА для отбора гомологичных аррА генов 62
2.3.2. Изоляция гена phyX с неизвестной функцией, гомологичного аррА Е. coii, из хромосомы О. proteus 63
2.3.3. Последовательность фрагмента, содержащего veviphyX. 63
2.3.4. Экспрессия гена phyX в Е. coli 65
2.3.5. Замена концевой короткой С-концевой части РЬуХ приводит к воссозданию фитазной активности 65
3. Клонирование генов, кодирующих внутриклеточные фит азы бактерий 68
3.1. Изоляция, характеризация и экспрессия гена из бактерии Obesumbacterium proteus 68
3.1.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки 68
3.1.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента 70
3.1.3. Изоляция генов фитаз из других штаммов О. proteus 72
3.2. Изоляция гена фитазы из бактерии Citrobacter jreundii 73
3.2.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки 73
3.2.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента 75
3.2.3. Изоляция гена фитазы из штамма С. Jreundii Е3638 76
3.3. Изоляция гена фитазы из бактерии К cloaceae 77
3.3.1. Отбор клонов е фитазной активностью из геномной библиотеки 77
4. Анализ аминокислотных последовательностей клонированных генов 79
4.1. Выравнивание последовательностей белков-гомологов 79
4.1.1. Консервативность аминокислотных остатков активного центра 82
4.1.2. Консервативность дисульфидньгх связей 83
4.1.3. Сигнальные неї ггиды 84
4.1.4. Вторичная структура 84
4.1.5. Филогенетическое дерево 85
4.2. Вычисление «консенсусных» последовательностей на основе имеющихся последовательностей фитаз. 87
5. Экспрессия генов фитаз 88
5.1. Экспресиия фитаз в Е. coli BL21 (DE3) 89
5.1.1. Описание системы. 89
5.1.2. Определение удельной активности ферментов 89
5.1.3.Изучение свойств ферментов 92
5.1.4. Субстратная специфичность ферментов 95
5.2. Экспрессия фитаз в дрожжах. 96
5.2.1. Экспрессия АррА. coli в различных дрожжевых системах 96
5.2.2. Экспрессия фитаз С. fieundii и О. proteus в P. pastoris 98
5.2.3. Свойства рекомОинантных фитаз из P. pastoris 99
V. Заключение..., „.,„ , 101
VL Выводы . „„„ 105
VII Список литературы . 106
