Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Микозы – заболевания, вызываемые грибными патогенами 14
1.1.1. Классификация представителей микромицетов, способных вызывать микозы 15
1.1.2. «Группы риска» при микозах 15
1.1.3. Группы микозов. 16
1.1.4. Существующие средства борьбы с микозами человека и животных и их классификация 16
1.2. Противогрибковые химиопрепараты, применяемые в медицине 18
1.2.1. Полиены 18
1.2.2. Азолы 19
1.2.3. Аллиламины 19
1.2.4. Препараты разных групп 20
1.3. Патологии животных, вызываемые микромицетами, и способы их лечения 20
1.4. Борьба с патогенными грибами в растениеводстве 22
1.5. Использование антимикотических веществ в пищевой промышленности 24
1.6. Недостатки существующих антифунгальных препаратов 25
1.7. Бактерии рода Bacillus 26
1.7.1. Проблемы классификации бацилл 26
1.7.2. Группы патогенности бацилл 27
1.7.3. Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов и липопептидов 28
1.7.4. Антибиотики и бактериоцины бактерий рода Bacillus 32
1.7.5. Аминогликозиды 33
1.8. Заключение по обзору литературы 35
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Штаммы микроорганизмов 37
2.2. Питательные среды для культивирования микроорганизмов 38
2.3. Определение биологических свойств штамма Lhv-97 39
2.3.1. Определение вида штамма Lhv-97 по ДНК-последовательности участка гена 16S рРНК 39
2.3.2. Биобезопасность штамма B. mojavensis Lhv-97 40
2.4. Определение активности штамма B. mojavensis Lhv-97 в отношении патогенов человека и животных 41
2.5. Исследование устойчивости антимикробной активности B. mojavensis Lhv-97 к различным факторам 42
2.5.1. Термоустойчивость 42
2.5.2. Устойчивость к протеолизу 42
2.5.3. Влияние диализного разделения на метаболическую активность 42
2.6. Выделение и определение состава действующего вещества штамма B. mojavensis Lhv-97 43
2.6.1. Экстракция БФ КЖ различными растворителями 43
2.6.2. Разделение активных метаболитов штамма B. mojavensis Lhv-97 методом обращенно-фазовой хроматографии низкого давления 43
2.6.3. Разделение активных метаболитов штамма B. mojavensis Lhv-97 методом обращенно-фазовой хроматографии высокого давления 44
2.6.4. Разделение активных метаболитов B. mojavensis Lhv-97 методом эксклюзионной хроматографии низкого давления 44
2.6.5. Определение чистоты и молекулярной массы активного компонента 44
2.6.6. Газохроматографическое определение структуры активного компонента штамма B. mojavensis Lhv-97 45
2.7. Подбор состава питательных сред и эффективных условий культивирования в колбах 45
2.8. Периодическое культивирование B. mojavensis Lhv-97 в ферментере с целью получения антимикробных метаболитов 46
2.9. Методы получения прототипов биопрепаратов на основе штамма B. mojavensis Lhv-97 47
2.9.1. Получение сухого препарата на основе клеток штамма B. mojavensis Lhv-97 47
2.9.2. Получение альгинатных и хитозановых гранул и оценка их свойств 47
2.9.3. Получение липосом на основе АМВ штамма B. mojavensis Lhv-97 50
2.10. Методика определения активности препарата на основе штамма B. mojavensis Lhv-97 in vivo 51
Глава 3 Основные результаты и их обсуждение 53
3.1. Поиск нового штамма-антагониста, как потенциального продуцента антимикотических веществ 53
3.1.1. Оценка антагонистических свойств микроорганизмов из коллекции ФРМ в отношении грибных патогенов 53
3.1.2. Спектр активности штамма Lhv-97 в отношении грибных и бактериальных патогенов человека, животных и растений 56
3.1.3. Биологическая безопасность штамма Lhv-97 58
3.1.4. Заключение по разделу 3.1 59
3.2. Видоидентификация штамма Lhv-97 59
3.2.1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Lhv-97 59
3.2.2. Биофизический метод видоидентификации штамма Lhv-97 60
3.2.3. Генетический анализ участка гена 16S рРНК с целью видоидентификации штамма Lhv-97 60
3.2.4. Результаты видоидентификации 60
3.3. Подбор сред и условий культивирования штамма B. mojavensis Lhv-97 60
3.3.1. Подбор источников углерода и азота 61
3.3.2. Подбор температуры культивирования штамма B. mojavensis Lhv-97 62
3.3.3. Подбор концентрации дрожжевого экстракта 64
3.3.4. Изучение динамики продукции антифунгальных метаболитов в процессе ферментации 64
3.3.5. Заключение по разделу 3.3 65
3.4. Исследование стабильности антифунгальных метаболитов штамма B. mojavensis Lhv-97 под влиянием различных факторов 65
3.4.1. Термоустойчивость 65
3.4.2. Устойчивость к протеолизу 66
3.4.3. Определение размеров молекул активных метаболитов штамма B. mojavensis Lhv-97 методом диализа 66
3.4.4. Заключение по разделу 3.4 67
3.5. Очистка действующего вещества штамма B. mojavensis Lhv-97 и определение его химической структуры 67
3.5.1. Обращенно-фазовая хроматография низкого давления 67
3.5.2. Использование ВЭЖХ 70
3.5.3. Эксклюзионная хроматография 74
3.5.4. Определение чистоты и молекулярной массы выделенного антимикотического компонента штамма Lhv-97 75
3.5.5. Использование газовой хроматографии для определения состава антимикотического компонента штамма Lhv-97 77
3.5.6. Заключение по разделу 3.5 88
3.6. Исследование активности выделенного антимикотического вещества штамма B. mojavensis Lhv-97.. 89
3.6.1. Определение минимальной подавляющей концентрации АМВ штамма B. mojavensis Lhv-97 89
3.6.2. Сравнение активности АМВ штамма B. mojavensis Lhv-97 с применяемыми в медицине препаратами 89
3.7. Создание прототипов биопрепаратов на основе штамма B. mojavensis Lhv-97 91
3.7.1. Приготовление и испытания сухого препарата на основе клеток штамма B. mojavensis Lhv-97 для защиты растений 93
3.7.2. Разработка инкапсулированных форм прототипа препарата на основе АМВ штамма B. mojavensis Lhv-97 95
3.7.2.1. Разработка альгинатных и хитозановых гранул 95
3.7.2.2. Разработка липосомальной формы прототипа препарата на основе штамма B. mojavensis Lhv-97 98
3.7.3. Заключение по разделу 3.7 102
3.8. Испытания препарата на основе АМВ штамма B. mojavensis Lhv-97 против кандидоза ротовой полости у мышей 103
Заключение 105
Выводы 108
Список использованных источников 109
Список работ, опубликованных по теме диссертации 125
Приложение А 128
Приложение Б 129
Приложение В 130
