Введение
Часть 1. Обзор литературы 9
Глава 1. Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме прокариот. 11
1.1. Ферменты, вовлекающие неорганические полифосфаты в превращение нуклеозидфосфатов. 12
1.1.1. Полифосфаткиназа (полифосфат:АОР фосфотрансфераза, КФ 2.7.4.1). 12
1.1.2. Полифосфат:АМР-фосфотрансфераза. 17
1.1.3. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании NAD+. 20
1.2. Реакции трансфосфорилирования, в которых неорганические полифосфаты заменяют АТР. 21
1.2.1. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании глюкозы и других Сахаров . 21
1.2.2. 1,3-дифосфоглицерат : полифосфат-фосфотрансфераза (КФ 2.7.4.17). 25
1.2.3. Участие неорганических полифосфатов в фосфорилировании белков. 25
1.3. Запасание энергии неорганических полифосфатов в виде Дц.Н+. 25
Глава 2. Неорганические полифосфаты в энергетическом метаболизме зукариот . 26
Глава 3. Неорганические полифосфаты в митохондриях дрожжей. 31
Часть 2. Материалы и методы исследования. 36
2.1. Объекты исследования. 36
2.2. Состав среды и условия культивирования. 36
2.3. Получение сферопластов из дрожжевых клеток. 37
2.4. Условия гиперкомпенсации. 38
2.5. Получение фракции цитозоля. 39
2.6. Выделение митохондрий. 39
2.7. Очистка препарата митохондрий. 41
2.8. Определение поглощения кислорода митохондриями дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 41
2.9. Получение растворимой фракции митохондрий и фракции митохондриальных мембран. 41
2.10. Получение фракций содержимого межмембранного пространства митохондрий и митопластов. 42
2.11. Определение полифосфаткиназой активности в изолированных митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 43
2.12. Инкубация изолированных митохондрий Saccharomyces cerevisiae 43
2.13. Определение молекулярных масс экзополифосфатаз. 44
2.14. Экстракция неорганических полифосфатов. 44
2.15. Осаждение неорганических полифосфатов в виде нерастворимых солей бария. 45
2.16. Хроматография неорганических полифосфатов на бумаге. 46
2.17. Электрофорез неорганических полифосфатов в ПААГ. 46
2.18. Очистка неорганических полифосфатов от примесей ортофосфата и пирофосфата, 47
2.19. Определение ферментативных активностей. 47
2.20. Аналитические методы, 49
2.20.1. Определение ортофосфата. 49
2.20.2. Определение пирофосфата, 49
2.20.3. Определение белка. 50
2.20.4. Определение глюкозы. 50
Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1. Обнаружение неорганических полифосфатов в препарате изолированных митохондрий Saccharomyces cerevisiae. 52
3.2. Экзополифосфатаза растворимой фракции митохондрий Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации. 57
3.3. Сравнение влияния недостатка и избытка РІ в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах и митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 58
3.3.1. Влияние недостатка и избытка Р; в среде на содержание неорганических полифосфатов в сферопластах Saccharomyces cerevisiae . 58
3.3.2. Влияние недостатка и избытка РІ в среде на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 61
3.3.3, Влияние недостатка и избытка РІ в среде на активность экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae. 66
3.4. Определение локализации неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 67
3.5. Определение полифосфаткиназной активности в изолированных митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 69
3.6. Действие ингибиторов энергетического обмена на накопление неорганических полифосфатов в митохондриях и сферопластах, а также на активности экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae . 72
3.7. Влияние источника углерода на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов, а также на активность экзополифосфатаз митохондрийSaccharomyces cerevisiae. 76
3.8. Влияние инактивации генаррг/, кодирующего экзополифосфатазу и renapprtJ, кодирующего эндополифосфатазу, на обмен неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 83
3.8.1. Инактивация гена эндополифосфатазы/рт/ приводит к неспособности клеток Saccharomyces cerevisiae использовать несбраживаемые субстраты. 83
3.8.2. Влияние инактивации геновppxl uppnl на активность экзополифосфатаз митохондрий Saccharomyces cerevisiae. 86
3.8.3. Растворимая экзополифосфатаза митохондрий Saccharomyces cerevisiae кодируется геном ppxl. 88
3.8.4. Влияние инактивации гена ррпі на содержание и длину цепи неорганических полифосфатов в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. 89
Заключение 92
Выводы 9^
Список литературы 99
