Введение
1. Введение 7
1.1. Актуальность темы исследования 7
1.2. Степень разработанности темы 8
1.3. Цель 8
1.4. Методология и методы исследования 9
1.5. Научная новизна 9
1.6. Теоретическая и практическая значимость работы 9
1.7. Положения, выносимые на защиту 10
1.8. Апробация результатов 10
1.9. Личное участие автора в получении результатов 11
1.10. Структура и объём диссертации 11
2. Обзор литературы 12
2.1. Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36 12
2.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1 12
2.1.2. Структура генов ИЛ-36 13
2.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36 14
2.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов 15
2.1.5. Секреция ИЛ-36 17
2.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36 18
2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1 20
2.1.8. Биологические функции ИЛ-36 21
2.2. Псориаз и цитокины группы ИЛ-36 22
2.2.1. Клинико-демографическая характеристика псориаза 22
2.2.2. Современные представления о патогенезе псориаза 23
2.2.3. Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза з
2.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапия 27
3. Материалы и методы исследования 30
3.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА 30
3.1.1. Штаммы бактерий 30
3.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформации 30
3.1.3. Электротрансформация клеток E. coli 31
3.1.4. Отбор трансформированных клонов 31
3.1.5. Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E. coli 31
3.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА 34
3.2.1. Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РА 35
3.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах 35
3.2.3. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в биореакторе (ферментере)
3.3. Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РА 37
3.4. Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА
3.4.1. Флоккуляция 38
3.4.2. Кислотное фракционирование 38
3.5. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА 39
3.5.1. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow 39
3.5.2. Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow 40
3.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S 41
3.5.4. Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами к ИЛ-36РА 3.5.4.1. Иммобилизация антител на сорбенте 41
3.5.4.2. Аффинная хроматография 42
3.6. Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РА 43
3.7. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия 44
3.8. Вестерн блот для определения ИЛ-36РА 44
3.9. Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114
3.10. Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализа 45
3.11. Количественное определение ЛПС 46
3.12. Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах
3.12.1. Спектрофотометрическое определение 46
3.12.2. Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотой 46
3.12.3. Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФА 47
3.13. Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест системы на основе клеточной линии А549 48
3.13.1. Культивирование клеток А549+36 48
3.13.2. Оценка биологической активности ИЛ-36РА 48
3.13.3. Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФА 49
3.13.4. Расчет активности образцов ИЛ-36РА 3.14. Искусственное окисление ИЛ-36РА 49
3.15. Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА 50
3.16. ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА
3.16.1. ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РА 50
3.16.2. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси непроцессированной и окисленной форм ИЛ-36РА 51
3.16.3. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114 51
3.16.4. ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РА
3.17. Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощью капиллярного изоэлектрофокусирования 51
3.18. Динамическое светорассеяние 52
3.19. Статистическая обработка результатов 53
4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Получение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойств
ИЛ-36РА 54
4.1.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E. coli BL21[DE3] 54
4.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммами-продуцентами безметионинового ИЛ-36РА 61
4.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА 66
4.1.4. Изучение биологической активности ИЛ-36РА
4.1.4.1. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных штаммов-продуцентов 70
4.1.4.2. Биологическая активность ИЛ-36РА в модели псориазоподобного дерматита на мышах 72
4.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА 75
4.2. Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА 79
4.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе, исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА 79
4.2.1.1. Отработка условий лизиса биомассы штамма-продуцента в лабораторном масштабе 79
4.2.1.2. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабе 80
4.2.1.3. Изучение гетерогенности ИЛ-36РА 84
4.2.1.4. Оптимизация условий хранения ИЛ-36РА 93
4.2.2. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производства 97
4.2.2.1. Оптимизация метода лизиса биомассы штамма-продуцента и осветление лизатов методом флоккуляции 97
4.2.2.2. Масштабирование метода очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии 101
4.2.2.3. Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114 104
4.2.2.4. Метод очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии: материальный баланс 109
4.2.3. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в
масштабе пилотного промышленного производства 113
4.2.3.1. Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА 113
4.2.3.2. Оптимизация метода очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии 115
4.2.3.3. Метод очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии: материальный баланс
5. Заключение 122
6. Выводы 123
7. Список сокращений 124
8. Список литературы 126
