Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Общие сведения о вирусе АЧС 11
1.2 Строение и структура вириона вируса АЧС 14
1.3 Структурные белки вируса АЧС 17
1.4 Генетическая вариабельность 19
1.5 Механизмы репродукции вируса АЧС 20
1.5.1 Репликация в клетке 20
1.5.2 Механизм распространения вируса АЧС у свиней 22
1.5.3 Репликация вируса АЧС у клещей 1.6 Механизмы формирования иммунного ответа 24
1.7 Лабораторные методы диагностики АЧС 28
1.8 Методы и системы получения рекомбинантных белков 33
1.9 Заключение по обзору литературы 37
2 Собственные исследования 39
2.1 Материалы и оборудование 39
2.2 Методы исследований 44
3 Результаты собственных исследований 51
3.1 Биоинформатический анализ белков вируса АЧС 51
3.1.1 Анализ вариабельности белков вируса АЧС 51
3.1.2 Анализ гликозилирования белков вируса АЧС 55
3.1.3 Анализ гидрофильности белков вируса АЧС 57
3.2 Создание библиотеки генов вируса АЧС 60
3.2.1 Подбор праймеров 60
3.2.2 Оптимизация условий амплификации 62
3.2.3 Клонирование полноразмерных копий генов в клонировочный вектор 64
3.3 Клонирование полноразмерных копий генов в экспрессирующие вектора pGFP-N1 и pCMV-HA-С и экспрессия в эукариотических клетках 68
3.4 Оценка уровня экспрессии и локализации рекомбинантных белков р17GFP, р54GFP 71
3.5 Сравнение диагностической эффективности серологических тестов для диагностики АЧС 73
3.6 Получение культурального антигена 76
3.7 Использование рекомбинантных белков в иммунологических реакциях
3.7.1 Иммуноблотинг 77
3.7.2 Иммуноферментный анализ 79
3.7.3 Иммунопероксидазный тест для выявления рекомбинантных белков в трансфецированных эукариотических клетках 81
3.8 Получение рекомбинантного эпитопа белка р17С вируса АЧС в
Escherichia coli 82
3.8.1 Подбор специфических праймеров и условий амплификации фрагмента гена содержащего эпитоп р17С 83
3.8.2 Клонирование эпитопа белка р17С вируса АЧС в вектор рET-32a(+) 84
3.8.3 Экспрессия эпитопа белка р17 вируса АЧС в бактериальных клетках Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) pLysS рЕТ32а/ASFV/p17ep/2 85
3.8.4 Очистка рекомбинантного эпитопа белка р17С вируса АЧС
4 Обсуждение результатов исследований 88
5 Заключение 95
6 Практические предложения 98
7 Список сокращений 99
8 Список использованной литературы
