Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 17
1.1. Спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato как возбудитель иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) . 17
1.1.1 . История открытия возбудителя ИКБ . 17
1.1.2. Эпидемиология иксодового клещевого боррелиоза 18
1.1.2.1. Географическое распространение возбудителя ИКБ . 18
1.1.2.2. Пути передачи Borrelia burgdorferi sensu lato . 22
1.1.3 Патогенез и клиника ИКБ 26
1.1.4. Механизмы уклонения спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato от иммунной системы хозяина 31
1.2. Морфологические и генетические особенности спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato 36
1.3. Антигены спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato 38
1.3.1. Семейство внешних поверхностных протеинов (Osp) . 39
1.3.2. Декорин-связывающие белки (Dbp) . 41
1.3.3. Флагеллярные белки (Fla) . 42
1.3.4. Белок Р83 . 43
1.3.5. Белок Р66 . 44
1.3.6 . Семейство основных мембранных белков (Вмр) 44
1.3.7. Белок P35 . 45
1.4. Диагностика ИКБ . 46
1.4.1. Обнаружение спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato в биологических образцах методом культивирования на питательных средах . 46
1.4.2. ДНК-диагностика ИКБ 47
1.4.3. Серодиагностика ИКБ . 48
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований . 55
2.1. Реактивы, реагенты и прочие материалы . 55
2.2. Методы работы с ДНК . 57
2.2.1. Получение суммарного препарата ДНК из клещей . 57
2.2.2. Получение суммарного препарата ДНК из культур боррелий... 58
2.2.3. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 58
2.2.4. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний E.coli 58
2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях . 58
2.2.6. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на мелкодисперсном оксиде кремния «Силика» . 59
2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 59
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНК-лигазы бактериофага T4 . 59
2.2.9. Амплификация ДНК в системе ПЦР . 60
2.3. Методы работы с бактериями 61
2.3.1. Используемые среды и общие приемы . 61
2.3.2. Изоляция спирохет B.burgdorferi s.l. из клещей . 62
2.3.3. Изоляция спирохет B.burgdorferi s.l. с помощью заражения мышей 62
2.3.4. Обнаружение ДНК боррелий в культуре и генотипирование изолятов с помощью ПЦР . 63
2.3.5. Обнаружение ДНК боррелий в клещах и генотипирование изолятов с помощью ПЦР 64
2.3.6. Трансформация компетентных клеток E.coli . 64
2.4. Индукция экспрессии клонированных генов боррелий в клетках E.coli 64
2.4.1. Индукция экспрессии генов, клонированных в составе вектора pREB-SAT, либо в его производных 64
2.4.2. Индукция экспрессии генов, клонированных в клетках E.coli в составе вектора рЕТm
2.5. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ . 65
2.6. Очистка рекомбинантных белков аффинной хроматографией на никель-хелатном сорбенте 65
2.7. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков боррелий . 66
2.7.1. Используемые сыворотки 66
2.7.2. Твёрдофазный иммуноферментный анализ 67
2.8. Определение первичной структуры фрагментов ДНК, сравнение аминокислотных последовательностей . 69
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 71
3.1. Получение изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и определение их геновидовой принадлежности 71
3.1.1. Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l., выделенных из клещей 71
3.1.2 . Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l. с помощью заражения лабораторных мышей . 72
3.2. Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами B.burgdorferi s.l 73
3.3. Конструирование векторов для экспрессии рекомбинантных белков клетках E.coli 77
3.3.1. Клонирование гена gfp в E.coli в составе вектора pREB 80
3.3.2. Конструирование плазмиды pREB3 . 81
3.3.3. Конструирование плазмиды pRAC 81
3.3.4. Конструирование вектора pRAC3 86
3.4. Выбор генов спирохет Borrelia burgdorferi s.l. для клонирования в E.coli в составе экспрессирующих векторов . 88
3.5. Амплификация кодирующих областей генов ospC, ospA, flaA, flaB и dbpB B.garinii 20047T и ospC B.afzelii, подготовка к клонированию . 90
3.6. Клонирование генов ospC и ospA в составе вектора pRAC3 91
3.7. Модификация коммерческого вектора pET36b(+) 93
3.8. Клонирование кодирующих областей генов flaA, flaB и dbpB в составе вектора рЕТm 97
3.9. Переклонирование кодирующих областей генов ospA, ospC и flaA в составе вектора pETm 98
3.10. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков FlaA, FlaB, DbpB, OspA, OspC B.garinii группы 20047Т и OspC B.afzelii . 100
3.10.1. Сравнительный анализ последовательностей антигена FlaA... 101
3.10.2. Сравнительный анализ последовательностей антигена FlaB 101
3.10.3. Сравнительный анализ последовательностей антигена DbpB.. 102
3.10.4. Сравнительный анализ последовательностей антигена OspA.. 102
3.10.5. Сравнительный анализ последовательностей антигена OspC B.afzelii (изолят NSK-05-06) . 103
3.10.6 Сравнительный анализ последоваетльностей антигена OspC B.garinii группа 20047Т (изолят NSK-10-06) . 103
3.11. Получение и очистка рекомбинантных белков 104
3.12. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков в ИФА с сыворотками больных иксодовым клещевым боррелиозом 108
3.12.1. Определение оптимальной концентрации антигена 108
3.12.2. Анализ иммунореактивности рекомбинантных антигенов боррелий в ИФА с сыворотками больных ИКБ 109
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 113
Заключение . 127
Выводы 128
Список литературы . 129
Приложение . 156
