Введение
1. Обзор литературы. 9
1.1. Методологические основы получения трансгенных животных. 9
1.1.1. Микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы, значение метода. 14
1.1.2. Другие перспективные методы переноса чужеродной генетической информации в организм млекопитающих. 20
1.2. Методы анализа интеграции чужеродных генов. 27
1.2.1. Метод дот- и блот-гибридизации по Саузерну. 28
1.2.2. Метод полимеразной цепной реакции в применении к анализу трансгенных животных.29
1.2.3. Визуализация чужеродных генов при использовании генов-маркеров. 30
1.3. Особенности экспрессии чужеродных генов в организме трансгенных животных. 32
1.3.1. Значение регуляторных последовательностей целевых генов для экспрессии в организме животного. 32
1.3.2. Использование металлотиониинового промотора при создании экспрессирующихся векторов для трансгенных животных. 34
1.4. Возможности практического использования трансгенных сельскохозяйственных животных. 37
1.4.1. Трансгенные сельскохозяйственные животные как продуценты биологически активных веществ. 38
1.4.2. Изменение хозяйственно-полезных признаков у трансгенных животных. 39
1.4.3. Трансгенез как способ повышения устойчивости животных к неблагоприятным условиям, болезням и другим стресс-факторам. 42
1.5. Кролики в биотехнологии: лабораторные животные в изучении трансгенеза и трансгенные животные-продуценты биологически активных веществ. 44
1.6. Значение исследования и применения интерферонов для молекулярной биологии, медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. 50
1.7. Общие сведения о структурной организации гена интерферона-pl человека и некоторых физико-химических свойствах. 51
1.8. Перспективы получения и использования трансгенных сельскохозяйственных животных с генами интерферонов, и, в частности, с геном интерферона-[М человека. 52
2. Материалы и методы.
2.1. Бактериальные штаммы. 53
2.2. Плазмиды. 53
2.3. Кролики. 53
2.4. Трансформация. 53
2.5.. Выделение ДНК. 54
2.5.1. Выделение ДНК кролика. 54
2.5.2. Аналитическое выделение ДНКплазмид. 55
2.5.3. Препаративное выделение ДНК плазмид. 55
2.5.4. Элюция фрагментов ДНК плазмид. 55
2.6. Конструирование вектора pMTIFNpl. 56
2.7. Препараты ферментов. 57
2.8. Олигонуклеотидные праймеры. 57
2.9. Микроинъекция. 58
2.10. Трансплантация эмбрионов. 59
2.11. Полимеразная цепная реакция. 59
2.12. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. 60
2.13. Блот-гибридизация. 60
2.14. Внутрикожное заражение кроликов вирусом миксоматоза. 60
2.15. Заражение кроликов лапинизированным вирусом классической чумы свиней. 61
2.16. Размножение трансгенных кроликов. 62
2.17. Определение активности интерферона в сыворотке крови . 62
2.18. Изучение индуцированной экспрессии гена интерферона. 63
3. Результаты исследований. 64
3.1. Конструирование вектора с геном интерферона-Р I человека под контролем металлотиониинового промотора , потенциально способного экспрессироваться в клетках млекопитающих. 64
3.2. Проведение микроинъекций плазмидной ДНК в оплдотворенные яйцеклетки кролика и пересадка их животным-реципиентам, 66
3.3. Анализ родившихся крольчат на наличие гена интерферона-р 1 человека в геноме. 67
3.4. Определение титра интерферона-Р 1 человека в сыворотке крови трансгенов. 70
3.5. Изучение устойчивости к вирусным заболеваниям особей с
установленной интеграцией целевого гена. 72
3.5.1. Устойчивость к заболеванию миксоматозом. 72
3.5.2. Иммунный статус кроликов при заражении классической чумой свиней и вирусом миксомы. 77
3.6. Воспроизводительная способность трансгенных кроликов с геном рі-интерферона человека путем разных форм скрещивания. 80
3.7. Изучение возможности передачи чужеродного гена потомству. 84
4. Обсуждение результатов исследований. 86
5. Выводы. 97 7. Практические предложения. 99
8. Список литературы.
