Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Противовирусные вакцины 11
1.1.1. Цельновирионные вакцины 14
1.1.1.1. Живые аттенуированные вакцины 14
1.1.1.2. Инактивированные вакцины 20
1.1.2. Вакцины на основе вирусных антигенов 22
1.1.2.1. Живые генно-инженерные поливалентные вакцины 27
1.1.2.2. ДНК-вакцины 29
1.2. Мукозальные вакцины 34
1.2.1. Иммунитет слизистых оболочек 34
1.2.2. Съедобные вакцины на основе трансгенных растений 42
1.2.2.1. Перенос генов из бактерий рода Agrobacterium в растения 43
1.2.2.2. Экспрессия чужеродных генов в растениях 52
1.2.2.3. Противовирусные вакцины на основе трансгенных растений 56
2. Материалы и методы 70
2.1. Материалы 70
2.1.1. Реактивы, наборы реактивов, ферменты 70
2.1.1.1. Наборы реактивов 70
2.1.1.2. Реактивы 70
2.1.1.3. Ферменты имаркеры молекулярных весов 72
2.1.2. Оборудование и материалы 72
2.1.3. Бактериальные штаммы, плазмиды 73
2.1.4. Буферы, растворы, среды 73
2.1.4.1. Буферы 73
2.1.4.2. Растворы для трансформации клеток Е. coli 74
2.1.4.3. Растворы для выделения плазмидной ДНК 74
2.1.4.4. Питательные среды 75
2.1.5. Список праймеров 75
2.1.6. Наборы для проведения ИФА 76
2.1.7. Растения 77
2.2. Методы 77
2.2.1. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции 77
2.2.2. Лигирование 78
2.2.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli 79
2.2.4. Трансформация клеток is. coli 79
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК в аналитических количествах 80
2.2.6. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК 81
2.2.7. Полимеразная цепная реакция 81
2.2.8. Введение в З-ОН конец фрагмента ДНК a-32P-dNTP и a-33P-dNTP81
2.2.9. Гибридизация 81
2.2.10. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК 82
2.2.11. Очистка реакционной смеси для секвенирования 82
2.2.12. Анализ продукции TBI-HBsAg в тканях трансгенных растений 83
2.2.13. Иммунизация мышей 84
2.2.14. Анализ продукции антител у иммунизированных мышей 85
2.2.15. Статистическая обработка данных ИФА 86
3. Результаты и обсуждение 87
3.1. Конструирование плазмиды растительной трансформации 87
3.2. Получение плазмиды pBIN TBI-HBS 92
3.3. Перенос плазмиды pBIN TBI-HBS в клетки агробактерии 97
3.4. Создание трансгенных растений 98
3.5. Анализ интеграции целевого гена в геном растений 99
3.6. Анализ продукции белка TBI-HBsAg в трансгенных растениях... 100
3.7. Конструирование плазмиды для ДНК-вакцинации 103
3.8. Анализ иммуногенности плодов трансгенных томатов 106
4. Заключение 116
5. Выводы 121
6. Благодарности 125
7. Список литературы
