ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................ 7
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ....................................................................................................................... 20
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................. 20
1.1. Общая характеристика S. aureus...................................................................................... 20
1.2. Клиническое значение S. aureus ...................................................................................... 22
1.3. Эпидемиология и популяционная структура MRSA ..................................................... 29
1.4. Носительство S. aureus...................................................................................................... 32
1.5. Устойчивость S. aureus к бета-лактамным антибиотикам ............................................ 33
1.5.1. Фенотипы «исключения»: чувствительность MRSA к бета-лактамам (OS-MRSA) и
устойчивость MSSA к оксациллину (BORSA, MODSA).............................................................. 36
1.5.2. Роль высоких внутриклеточных концентраций c-di-AMP в формировании
устойчивости к антибиотикам, действующих на клеточную стенку .......................................... 38
1.6. Устойчивость к основным анти-MRSA антибиотикам ................................................. 39
1.7. Антибиотикотолерантность у S. aureus........................................................................... 43
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................ 46
2.1. Фенотипические методы исследований.......................................................................... 46
2.1.1. Коллекция бактериальных культур ................................................................................. 46
2.1.2. Оценка чувствительности к антибиотикам..................................................................... 46
2.1.3. Популяционный анализ .................................................................................................... 49
2.1.4. Селекция устойчивости при PAP-анализе с оксациллином.......................................... 50
2.1.5. Оценка кинетики отмирания бактерий под действием антибиотиков («time-killing»)
51
2.1.6. Оценка скорости роста...................................................................................................... 52
2.1.7. Оценка индуцированной аутолитической активности .................................................. 52
2.2. Эксперименты по адаптивной эволюции устойчивости in vitro................................... 53
2.2.1. Селекция устойчивости MRSA к цефтаролину, определение MPC............................. 54
2.2.2. Селекция устойчивости MSSA к бета-лактамам............................................................ 55
2.2.3. Селекция устойчивости к ванкомицину и даптомицину............................................... 56
2.2.4. Селекция под воздействием шоковых концентраций ванкомицина ............................ 57
2.2.5. Селекция под воздействием шоковых концентраций ципрофлоксацина, гентамицина
58
2.3. Молекулярные методы...................................................................................................... 59
3
2.3.1. Молекулярное типирование (SCCmec, spa, MLST) ....................................................... 59
2.3.2. Полногеномное секвенирование...................................................................................... 59
2.3.3. Выделение белка, трипсинолиз и белковое профилирование ...................................... 60
2.3.4. Оценка экспрессии генов, кодирующих пенициллинсвязывающие белки ................. 61
2.4. Генно-инженерные методы .............................................................................................. 62
2.4.1. Направленное геномное редактирование гена gdpP...................................................... 62
2.5. Биоинофрматичсекие методы .......................................................................................... 65
2.5.1. Сборка геномов и их аннотация....................................................................................... 65
2.5.2. Типирование in silico......................................................................................................... 66
2.5.3. Добавление геномных данных из ранее проведенных исследований.......................... 66
2.5.4. Филогенетический и пангеномный анализ..................................................................... 66
2.5.5. Филогенетический анализ с оценкой времени дивергенции ........................................ 68
2.5.6. Аннотация и картирование генов резистентности in silico........................................... 68
2.5.7. Аннотация мутаций и выявление аллельной глубины при анализе данных геномного
секвенирования................................................................................................................................. 68
2.5.8. Доступность данных в публичных репозиториях.......................................................... 69
2.6. Статистические методы и визуализация данных ........................................................... 70
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......................... 71
ГЛАВА 3 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К
АНТИБИОТИКАМ У ИЗОЛЯТОВ HA-MRSA И CA-MRSA.......................................................... 71
3.1. Описание коллекции изолятов MRSA............................................................................. 71
3.2. Оценка чувствительности к бета-лактамным антибиотикам........................................ 73
3.3. Оценка чувствительности к ванкомицину, даптомицину и липогликопептидным
антибиотикам.................................................................................................................................... 76
3.4. Анализ ассоциированной устойчивости, профили резистентности............................. 79
3.5. Заключение по главе: ассоциированная устойчивость MRSA в России ..................... 82
ГЛАВА 4 ОСОБЕННОСТИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У РАЗНЫХ
ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ MRSA..................................................................................................... 85
4.1. Молекулярное типирование MRSA................................................................................. 85
4.2. Сравнение чувствительности к антибиотикам среди доминирующих генетических
линий 86
4.3. Молекулярная характеристика изолятов MRSA со сниженной чувствительностью к
цефтаролину...................................................................................................................................... 89
4.3.1. Поиск мутаций в mecA (PBP2a), ассоциированных со снижением чувствительности к
цефтаролину...................................................................................................................................... 89
4.3.2. Оценка MPC и MSW цефтаролина .................................................................................. 90
4
4.4. Фенотипические, генотипические особенности OS-MRSA и механизмы,
ассоциированные с чувствительностью к бета-лактамам ............................................................ 92
4.4.1. Сравнение фенотипических методов выявления OS-MRSA ........................................ 96
4.4.2. Оценка гетерорезистентности и выделение субпопуляций OS-MRSA ..................... 100
4.4.3. Заключение по разделу: особенности Российских изолятов OS-MRSA и связанных с
ними механизмов чувствительности к бета-лактамам................................................................ 107
4.5. Анализ MRSA со сниженной чувствительностью к ванкомицину ............................ 110
ГЛАВА 5 АНАЛИЗ ГЛОБАЛЬНОЙ И ЛОКАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ
ДОМИНИРУЮЩИХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В РОССИИ......... 113
5.1. Анализ клональной структуры HA-MRSA ................................................................... 113
5.2. Популяционная структура доминирующего клона HA-MRSA ST8 .......................... 117
5.2.1. Реконструкция эволюции и времени появления генетической линии MRSA-ST8 .. 121
5.2.2. Заключение по разделу: глобальная и локальная эволюция генетической линии ST8
125
5.3. Популяционная структура доминирующего клона HA-MRSA ST239 ...................... 129
5.3.1. Заключение по разделу: глобальная и локальная эволюция генетической линии
ST239 132
5.4. Анализ клональной структуры CA-MRSA, выделенных у здоровых носителей...... 135
5.5. Сравнительная геномная характеристика «Газа-клона» ST22.................................... 138
5.5.1. Заключение по разделу: эпидемиология и эволюция генетической линии ST22..... 144
5.6. Сравнительная геномная характеристика MRSA-ST59............................................... 146
5.6.1. Заключение по разделу: глобальная и локальная эволюция генетической линии ST59
151
ГЛАВА 6 СЕЛЕКЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ IN VITRO ............................................................... 153
6.1. Стратегия получения резистентных мутантов при многоступенчатой селекции..... 153
6.1.1. Селекция устойчивости in vitro MRSA к цефтаролину............................................... 153
6.1.1.1. Фенотипические изменения при формировании устойчивости MRSA к цефтаролину
153
6.1.1.2. Мутационные события в процессе селекции на цефтаролине.................................... 155
6.1.1.3. Анализ белковых профилей у цефтаролин-устойчивых штаммов после селекции
устойчивости................................................................................................................................... 161
6.1.1.4. Заключение по разделу: mec-независимые механизмы устойчивости к цефтаролину
162
6.1.2. Селекция устойчивости MSSA к бета-лактамным антибиотикам и оценка
фенотипических изменений........................................................................................................... 165
6.1.2.1. Динамика изменения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам в процессе
селекции устойчивости in vitro ..................................................................................................... 167
5
6.1.2.2. Механизмы устойчивости MSSA к оксациллину......................................................... 170
6.1.2.3. Механизмы устойчивости MSSA к цефтаролину ........................................................ 172
6.1.2.4. Механизмы устойчивости MSSA к меропенему.......................................................... 173
6.1.2.5. Получение направленных делеций в гене gdpP на модельном штамме S. aureus
RN4220, анализ фенотипов............................................................................................................ 174
6.1.2.6. Влияние делеций в гене gdpP на уровень экспрессии пенициллинсвязывающих
белков 177
6.1.2.7. Заключение по разделу: mec-независимые пути формирования устойчивости к беталактамам и фенотипическая гетерорезистентность .................................................................... 180
6.1.3. Селекция устойчивости к даптомицину и ванкомицину............................................. 183
6.1.3.1. Фенотипические изменения при селекции на ванкомицине....................................... 183
6.1.3.2. Фенотипические изменения при селекции на даптомицине....................................... 185
6.1.3.3. Оценка динамики фенотипической гетерорезистентности......................................... 189
6.1.3.4. Оценка генотипических изменений при селекции на ванкомицине и даптомицине,
подходы к оценке генотипической гетерорезистентности......................................................... 192
6.1.3.5. Селекция контрольных штаммов................................................................................... 197
6.1.4. Оценка мутаций после селекции на ванкомицине и даптомицине ............................ 198
6.1.4.1. Генотипические изменения при селекции на ванкомицине........................................ 198
6.1.4.2. Генотипические изменения при селекции на даптомицине........................................ 200
6.1.4.3. Анализ формирования перекрестной устойчивости ванкомицин - и даптомицинустойчивых штаммов к липогликопептидам............................................................................... 202
6.1.4.4. Анализ мутационных событий, приводящих к переходу гетеромутаций в
гомомутации.................................................................................................................................... 205
6.1.4.4.1. Заключение по разделу: подходы к оценке гетеромутаций ................................. 207
6.1.4.5. Заключение по разделу: формирование независимых и общих путей устойчивости к
ванкомицину и даптомицину ........................................................................................................ 208
6.1.5. Изменение индуцированной аутолитической активности у мутантов, проявляющих
устойчивость к ванкомицину, даптомицину и цефтаролину ..................................................... 212
6.2. Селекция под воздействием шоковых концентраций антимикробных препаратов . 216
6.2.1. Селекция под воздействием шоковых концентраций ванкомицина: формирование
гетерорезистентности..................................................................................................................... 216
6.2.1.1. Генотипические изменения ............................................................................................ 219
6.2.1.2. Заключение по разделу: влияние высоких концентраций ванкомицина на
формирование гетерорезистентности........................................................................................... 222
6.2.2. Селекция под воздействием шоковых концентраций ципрофлоксацина:
формирование толерантности ....................................................................................................... 224
6
6.2.2.1. Оценка кросс-толерантности после воздействия шоковыми концентрациями
ципрофлоксацина ........................................................................................................................... 226
6.2.2.2. Заключение по разделу: оценка роли мутаций в пептидил-тРНК-гидролазе в
формировании универсальной толерантности к действию бактерицидных антибиотиков.... 230
6.2.3. Влияние шоковых концентраций гентамицина на формирование устойчивости и
мелкоколониевых фенотипов........................................................................................................ 233
6.2.3.1. Заключение по разделу: влияние воздействия шоковых концентраций гентамицина
на формирование устойчивости.................................................................................................... 237
ГЛАВА 7 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ: ТРАЕКТОРИИ ЭВОЛЮЦИИ
РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У S. AUREUS ........................................................... 241
7.1. Траектории эволюции клонов, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам
241
7.2. Траектории эволюции мутационных резистомов ........................................................ 245
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................................. 254
ВЫВОДЫ ....................................................................................................................................... 257
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................................................................... 259
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................... 260
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................. 262
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Патенты на изобретения .............................................................................. 307
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Свидетельства о депонировании штаммов ................................................ 308
ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Список основных работ, опубликованных по теме диссертации ............ 311
ПРИЛОЖЕНИЕ 4. География сбора изолятов MRSA............................................................... 313
ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Оценка изменения чувствительности (МПК, мкг/мл) к антибиотикам
различных классов у штаммов после селекции на ванкомицине, даптомицине и при пассажах на
среде без антибиотиков ..................................................................................................................... 314
ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Мутации и гетеромутации, выявленные у штаммов S. aureus при селекции
на оксациллине, меропенеме, цефтаролине..................................................................................... 316
ПРИЛОЖЕНИЕ 7. Мутации и гетеромутации, выявленные у штаммов S. aureus при селекции
на ванкомицине и даптомицине........................................................................................................ 322
