Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Транспорт нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих 8
1. 1.1. Механизмы транспорта нуклеиновых кислот в клетки 8
1.1.2. Методы изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки 12
1.1.3. Проблемы, связанные с использованием флуоресценции для изучения
транспорта нуклеиновых кислот в клетки, 14
1.1.3.1. Тушение флуоресценции 14
1.1.3.2. Использование реагентов, предотвращающих выгорание флуорохрома 16
1.1.3.3. Флуоресценция флуорохрома в составе нуклеиновых кислот 19
1.1.4. Транспорт флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов в клетки 23
1.2. Участие белков в транспорте нуклеиновых кислот в клетки 28
1.2.1. Выявление белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот 28
1.2.2. Идентификация белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот 39
1.2.2.1. Связывание нуклеиновых кислот с глицеральдегид-3*-фосфатдегидрогеназой .39
1.2.2.2. Связывание нуклеиновых кислот с альбумином 41
1.2.2.3. Белки, ответственные за транспорт нуклеиновых кислот в сперматозоиды 41
1.2.2.4. Связывание G-богатых олигонуклеотидов с пуклеолипом 43
1.2.2.5. Эзрин и моезин - компоненты транспортной системы 44
1.2.2.6. NACh - мембранный канал, транспортирующий короткие одноцепочечные
нуклеиновые кислоты 44
1.2.2.7. Каналы для транспорта нуклеиновых кислот могут формироваться из факторов транскрипции 45
1.2.3.7. MNAB - мембранный белок, связывающий нуклеиновые кислоты 45
1.2.2.7. Гепарин-связывающий интегрин Мас-1 46
1.2.2.10. Белки, участвующие в реализации иммуностимулирующего действия CpG ДНК 47
1.2.2.11. Участие скавенджер-рецептора в связывании и транспорте нуклеиновых кислот 48
1.2.2.12. Заключение 50
2. Материалы и методы 52
2.1. Материалы 52
2.2. Получение и очистка 2Р — меченых олигонуклеотидов 52
2.3. Синтез модифицированных олигонуклеотидов 53
2.4. Клетки и условия их культивирования 58
2.5. Приготовление слайдов и микроскопия .58
2.6. Аффинная модификация белков, связывающих нуклеиновые кислоты 59
2.7. Исследование специфичности аффинной модификации белков 60
2.8. Исследование локализации белков, связывающих нуклеиновые кислоты 60
2.9. Влияние целостности клеточной мембраны па модификацию белков, связывающих нуклеиновые кислоты, и внутриклеточный транспорт олигонуклеотидов 60
2.10. Определение констант диссоциации комплексов олигонуклеотид-белок и определение количества олигонуклеотид-связывающих белков на клетках 61
2.11. Получение и характеризация антител против флуоресцеина 61
2.12. Иммуноферментиое окрашивание 62
2.13. Аффинная хроматография олигонуклеотид-связывающих белков, модифицированных Flu-lys-p(N)i6-deg-Uo на ультрагелс А2 с иммобилизованными антителами против флуоресцеина 62
2.14. Синтез пептидов и изготовление конъюгатов этих пептидов с бычьим сывороточным альбумином 63
2.15. Приготовление человеческого сывороточного альбумина для иммунизации кроликов 65
2.16. Синтез сорбентов для выделения специфических антител против пептидов и человеческого сывороточного альбумина 65
2.17. Получение и характеризация антител против К1, К2е и альбумина 66
3. Результаты и обсуждение 67
3.1. Аффинная модификация реакционноспособными производными олигонуклеотидов поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения 67
3.2. Влияние условий инкубации аффинных реагентов с клетками на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков 76
3.3. Влияние ингибиторов активного транспорта на модификацию белков 78
3.4. Исследование локализации модифицированных белков 80
3.5. Влияние состояния клеточной мембраны на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков и транспорт олигонуклеотидов в клетки 82
3.6. Оценка количества олигонуклеотид-связывающих белков на поверхности клетки 86
3.7. Реакционноспособные олигонуклеотидные реагенты 87
3.8. Исследование транспорта флуоресцентно-меченых производных олигонуклеотидов в клетки различных линий 91
3.9. Исследование эффективности модификации поверхностных белков клеток линии А431 различными производными олигонуклеотидов 94
3.10. Исследование модификации клеток линии А431 реакционноспособными производными флуоресцентно-меченого олигонуклеотида 98
3.11. Получение антител против флуоресцеина и их взаимодействие с флуоресцеин-содержащимиолигонуклеотидами 100
3.12. Оптимизация условий выделения модифицированных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, на сорбенте с антителами против флуоресцеина 102
3.13. Выделение белков, связывающих нуклеиновые кислоты 103
3.14. Идентификация олигонуклеотид-связывающих белков 105
3.15. Изготовление конъюгатов и сорбентов па основе пептидов 106
3.16. Получение и тестирование антител против альбумина и пептидов р19ир13 107
3.17. Исследование клеточной локализации выделенных белков 110
3.18. Компьютерный анализ структуры альбумина 113
Выводы 116
Список литературы 118
