Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Развитие микроспектрометрии , 12
1.2. Применение микроспектрометрии 15
1.2.1. Изучение спектральных свойств витальных флуоресцентных зондов 15
1.2.2. Исследование противоопухолевых препаратов 17
1.2.3. Анализ собственной клеточной флуоресценции „ 19
1.2.4. Регистрация резонансного переноса энергии флуоресценции 20
1.2.5. Многоцветный анализ 22
1.3. Возможности применения микроспектрометрии в аналитической цитометрии 23
1.3.1. Цитомика , 23
1.3.2. Анализ плотных тканей , 24
1.3.3. Флуоресцентный гибридизационный анализ т 25
1.3.4. Многопараметрическое шшунофенотжирование 26
1.4. Методы аналитической цитометрии 27
1.4.1. Проточная цитометрия , , 27
1.4.2. Цитометрия изображений 27
1.4.3. Лазерная сканирующая цитометрия 28
1.4.4. Микроскопия с использованием ратиометрических красителей , 28
1.4.5. Микроскопическое измерение времени жизни флуоресценции 29
1.4.6. Флуоресцентная микроскопия в ближней инфракрасной области 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 31
2.1. Химические соединения и реагенты 31
2.1.1. Циклоимидные производные хлорина рб и бактериохлорина р 31
2.1.2. Цитохром с, его флуоресцентный аналог имутантные варианты 33
2.1.3. Цитотоксины из яда кобр 34
2.2. Регистрация активных форм кислорода и измерение фотостабнльности ЦИХЛ иЦИБХЛ 34
2.3. Работа с клетками и срезами тканей , 36
2.3.1. Инкубация с фотосенсибилизаторами 37
2.3.2. Идентификация клеточных органелл, внутриклеточного рН и активности протеаз 37
2.3.3. Облучение клеток с фотосенсибилизатором 39
2.3.4. Определение апоптоза и цитотоксичности 40
2.3.5. Электропоращия, , 40
2.3.6. Изучение механизма клеточного транспорта ЦТ 41
2.3.7. Подготовка образцов для микроскопии 41
2.3.8. Изучениее механизма действия цитотоксинов в реальном времени 42
2.3.9. Срезы тканей мышей 42
2.4. Флуоресцентная микроскопия и цитометрия . 43
2.4J. Определение цитотоксичности 44
2.4.2. Определение апоптотического индекса 47
2.4.3. Микроспектрометрия 49
2.4.4. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 52
2.4.5. Количественные измерения с помощью микроскопа Carl Zeiss LSMSJOMETA 53
2.4.6. Микроспектроцитометрия 54
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Применение МСЦ для измерения внутриклеточной концентрации и идентификации молекулярных взаимодействий фотосенсибилизаторов 57
3.1.1. Моделирование внутриклеточных взаимодействий фотосенсибилизаторов є растворах 57
3.1.2. Анализ взаимодействий и расчет концентрации фотосенсибилизаторов внутри клеток 59
3.2. Изучение структурно-функциональных связей ЦИХЛ и ЦИБХЛ... 62
3.2.1. Изучение способности генерации активных форм кислорода ЦИХЛ и ЦИБХЛ...62
3.2.2. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ и ЦИБХЛ64
3.2.3. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ и ЦИБХЛ 68
3.2.4. Фотоиндщированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИБХЛ 70
3.2.5. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р388 72
3.3. Применение МСЦ для выявления апоптоза и его связи с активностью митохондрий после фотоиндуцированного воздействия 75
3.4. Изучение цитохром с-индуцированного апоптоза 79
3.4.1. Активация апоптоза в клетках WEHI-3 экзогенным цитохромом с 79
3.4.2. Регистрация цитохрома с внутри клеток , 80
3.4.3. Изучение активности и роли митохондрий в ifumoxpOM с-индуцироваином апоптозе 82
3.4,4. Изучение проапоптотической функции мутантных форм цитохрома с 84
3.5. Анализ мишеней воздействия иммуномодулятора полиоксндония на клетки периферической крови человека 86
3.5.1. Изучение взаимодействия полиоксидопия с лейкоцитами крови 86
3.5.2. Локализация полиоксидопия в клетках фагоцитарного ряда 87
3.6. Применение МСЦдля изучения механизма действия цитотоксинов из яда кобр 89
3.6.1. Измерение цитотоксичности ЦТ в отношении опухолевых клеток и лейкоцитов крови 90
3.6.2. Локализация ЦТ в клетках HL-60 иЛ549 91
3.6.3. Изучение механизма интерпаятацж HT2No 94
3.6.4. Анализ локализации ЦТ2Ко и состояния клеточных структур при цитотоксических дозах 97
3.6.5. Эффекты субцитотоксических доз цитотоксинов 101
3.6.6. Предполагаемый механизм действия цитотоксинов 104
Заключение 106
Выводы 107
Список литературы
