Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Температурное воздействие и ответные реакции клеток растений 13
1.2. Синтез БТШ как ответная реакция клеток на изменение температуры
1.2.1. Синтез БТШ при тепловом воздействии 14
1.2.2. Роль активных форм кислорода в активации экспрессии БТШ 17
1.3. АФК как причина гибели клетки 19
1.3.1. Процессы, приводящие к гибели клетки 19
1.3.2. Типы гибели клеток и роль АФК 21
1.4. Типы и сайты продукции АФК в клетке 24
1.4.1. Типы АФК в клетке 24
1.4.2. Сайты продукции АФК 1.4.2.1. НАДФН-оксидаза (Rboh) (ЕС 1.6.3.1) 26
1.4.2.2. Пероксидазы (ЕС 1.11.1.7) 29
1.4.2.3. Хлоропласты 30
1.4.2.4. Пероксисомы 32
1.4.2.5. Митохондрии 32
1.5. Образование АФК компонентами дыхательной цепи 34
1.5.1. Комплекс 1 36
1.5.2. Комплекс II 39
1.5.3. Комплекс III 39
1.5.4. Комплекс IV 42
1.5.5. Альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы 1.6. Продукция АФК и митохондриальный мембранный потенциал 44
1.7. Выводы из обзора литературы 47
2. Материалы и методы 48
2.1. Объект исследования и условия культивирования 48
2.2. Температурное воздействие 49
2.3. Концентрации используемых агентов 50
2.4. Флуоресцентная микроскопия 50
2.5. Определение жизнеспособности 51
2.5.1. Определение жизнеспособности с использованием метода двойного окрашивания флуоресцентными красителями 51
2.5.2. Определение жизнеспособности по подсчету колониеобразующих единиц.. 2.6. Определение содержания АФК 52
2.7. Определение электрохимического митохондриального мембранного потенциала 2.8. Выделение суммарного белка 54
2.9. Проведение электрофореза в ПААГе с ДДС-Na 2.10. Окраска и обесцвечивание гелей 55
2.11. Вестерн-блоттинг 55
2.12. Статистическая обработка данных 56
3. Результаты 57
3.1. Ответная реакция на стрессовое воздействие у клеток растений 57
3.1.1. Содержание БТШ при действии ряда повышенных температур у суспензионных культур клеток озимой пшеницы и сахарного тростника 57
3.1.2. Изменение уровня АФК при действии повышенных температур у суспензионных культур клеток озимой пшеницы и сахарного тростника
3.1.2.1. Тепловое воздействие вызывает усиление продукции АФК 61
3.1.2.2. Образование АФК в зависимости от интенсивности теплового воздействия 63
3.1.3. Изменение потенциала на внутренней мембране митохондрий при действии
повышенных температур у суспензионных культур клеток озимой пшеницы и сахарного
тростника 65
3.1.3.1. Тепловое воздействие вызывает повышение митохондриального мембранного потенциала 65
3.1.3.2. Повышение митохондриального мембранного потенциала в зависимости от интенсивности теплового воздействия в клетках озимой пшеницы 69
3.1.3.3. Повышение митохондриального мембранного потенциала в зависимости от интенсивности теплового воздействия в клетках сахарного тростника 69
3.1.3.4. Эффект СССР на изменение МП в клетках озимой пшеницы при температурных воздействиях различной интенсивности
3.1.4. Сравнение интенсивности флуоресценции JC-1 и DCF после теплового воздействия различной интенсивности 73
3.1.5. Изменение интенсивности флуоресценции FDA при действии повышенных температур у суспензионной культуры клеток озимой пшеницы 76
3.1.6. Изменение жизнеспособности клеток суспензионных культур при действии повышенных температур 78
3.1.6.1. Жизнеспособность клеток культуры озимой пшеницы в зависимости от интенсивности теплового воздействия 78
3.1.6.2. Жизнеспособность клеток культуры сахарного тростника в зависимости от интенсивности теплового воздействия 3.1.7. Изменения продукции активных форм кислорода, митохондриального потенциала и жизнеспособности культуры клеток озимой пшеницы в зависимости от продолжительности теплового воздействия 45 С 88
3.1.8. Влияние протонофора СССР на продукцию АФК при тепловом воздействии у суспензионной культуры клеток озимой пшеницы 90
3.1.9. Эффект хелатора кальция и ингибитора кальциевых каналов на изменение потенциала на внутренней мембране митохондрий и содержания АФК в культуре клеток озимой пшеницы 93
3.1.10. Изменение митохондриального потенциала и уровня АФК при холодовом воздействии в культурах клеток озимой пшеницы и сахарного тростника 96
3.2. Ответная реакция на стрессовое воздействие у клеток дрожжей 99
3.2.1. Изучение изменения содержания АФК, потенциала на внутренней мембране митохондрий и жизнеспособности клеток Saccharomyces cerevisiae при тепловом воздействии. Эффект аскорбиновой кислоты на изменение данных процессов 99
3.2.2. Эффект протонофоров на снижение содержания АФК и повышение устойчивости к тепловому воздействию в клетках дрожжей 104
3.2.3. Митохондрии являются основным сайтом продукции АФК в клетках дрожжей при тепловом воздействии 112
4. Обсуждение 116
4.1. Зависимость между интенсивностью теплового воздействия и синтезом БТШ 116
4.2. Синтез БТШ и продукция АФК при тепловом воздействии 118
4.3. Продукция АФК и гибель клеток при тепловом воздействии 119
4.4. Признаки ПКГ при действии повышенных температур у клеток растений 121
4.5. Митохондрии - источники АФК в клетках растений и дрожжей при тепловом воздействии 122
4.6. Митохондриальный мембранный потенциал при тепловом воздействии 125
4.7. Гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны и продукция АФК
128
4.8. Зависимость между повышением митохондриального потенциала и внутриклеточным кальциевым гомеостазом 130
Заключение 133
Выводы 136
Список использованной литературы 137
