Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Ботаническая характеристика семейства Boraginaceae (бурачниковые) 10
1.2. Фитохимическая характеристика семейства Boraginaceae 10
1.3. Фармакологические свойства метаболитов кофейной кислоты 13
1.4. Биосинтез розмариновой кислоты и ее производных 16
1.5. Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы растений 23
1.6. Влияние гена rolC на трансформированные клетки растений 26
1.7. Влияние элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в клетках растений 30
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Объект исследования 32
2.2. Бактерии и плазмиды 32
2.3. Культивирование бактериальных штаммов 33
2.4. Питательные среды 34
2.5. Получение клеточных культур Е. sericeum 35
2.5.1. Получение контрольных и го/С-трансгенных культур Е. sericeum 35
2.5.2. Получение культуры трансгенных корней Е. sericeum 36
2.5.3. Получение клеточной линии Е-4 36
2.5.4. Динамика роста каллусных культур Е. sericeum и накопления ими полифенолов 36
2.6. Эксперименты с активаторами биосинтеза полифенолов. 37
2.7. Выделение плазмидной ДНК 37
2.8. Доказательство трансгенности и экспрессия генов 38
2.8.1. Выделение растительной ДНК 38
2.8.2. Полимеразная цепная реакция на препаратах ДНК 39
2.8.3. Выделение тотальной растительной РНК 39
2.8.4. Реакция обратной транскрипции 40
2.8.5. Полимеразная цепная реакция на препаратах кДНК 41
2.8.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-time PCR) 43
2.9. Секвенирование ДНК и кДНК 44
2.10. Определение содержания полифенолов в культурах клеток Е. sericeum 45
2.11. Исследование фармакологической активности метаболитов кофейной кислоты из каллусной культуры Е. sericeum 46
2.11.1. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на функцию почек у крыс 47
2.11.2. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления 47
2.11.3. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления 48
2.12 Статистическая обработка результатов 49
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50
3.1. Характеристика клеточных культур Е. sericeum 50
3.1.1. Клеточные культуры Е. sericeum 50
3.1.2. Доказательство трансгенности культур Е. sericeum 52
3.1.3. Доказательство экспрессии гена rolC в го/С-трансгенных культурах Е. sericeum 53
3.2. Накопление полифенолов в культуре клеток Е. sericeum 55
3.2.1. Содержание метаболитов кофейной кислоты в культурах корней и каллусов Е. sericeum 55
3.2.2. Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е. sericeum методом селекции 58
3.2.3. Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum 62
3.3. Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов 64
3.4. Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена rolC 66
3.4.1. Экспрессия генов PAL 66
3.4.2. Экспрессия генов CYP 68
3.5. Фармакологические свойства препарата из клеточной культуры Е. sericeum и возможность ее применения в медицине 74
3.5.1. Стабильность рабдозина и розмариновой кислоты в процессе сушки каллусов 74
3.5.2. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на функцию почек у крыс 76
3.5.3. Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления 79
3.5.4. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления 81
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86
ВЫВОДЫ 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
