Введение
ЧАСТЬ I. Динамическая структура хроматина 17
Глава 1. Структура и функции клеточного ядра (Обзор литературы) 18
1.1. Молекулярный и супрамолекулярныеуровни организации ДНК в клетках эукариот. 18
1.1.1. Первичная структура ДНК 19
1.1.2. Вторичная структура ДНК 21
1.1.3. Структуры ДНК высших порядков организации . 23
1.2. Суперспиральная конформация кольцевых молекул ДНК. 30
1.3. Суперспиральная ДНК клеточного ядра эукариот. 32
Глава 2. Результаты собственных исследований 38
2.1. Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот 38
2.2. Супрамолекулярная организация нуклеоидов эукариот 48
2.3. Прочно связанные с ДНК «остаточные» белки. 55
2.4. Белковый состав ядерного матрикса в клетках различных тканей . 63
2.5. Изменение супрамолекулярного комплекса ДНК под действием противоопухолевых химиотерапевтических препаратов. 73
Резюме. 80
ЧАСТЬ II. Программированная гибель опухолевых клеток при терапевтическом лечении онкологических заболеваний
Глава 3. Программированная гибель клеток (Обзор литературы) 86
3.1. Программированная гибель клеток 88
3.2. Каспазы 91
3.3. Рецепторы смерти 93
3.4. Роль митохондрий 99
3.5. Роль факторов роста 104
3.6. Гранзимы 105
3.7. Белки теплового шока 106
3.8. Транскрипционные факторы NF-кВ и р53 108
3.9. Протеасом ы 110
3.10. Другие сигнальные системы гибели/выживания клетки 112
3.11. Программированная гибель клеток в механизмах циторедуктивной терапии 113
Глава 4. Материалы и методы исследования 122
4.1. Материалы. 122
4.1.1. Клеточные линии и культуры 122
4.1.2. Противоопухолевые препараты и цитотоксины. 122
4.1.3. Моноклоналъные антитела 123
4.1.4. Реагенты и наборы реактивов 125
4.2. Методы исследования. 126
4.2.1. Реакция поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ). 126
4.2.2. Инкубация клеток с противоопухолевыми препаратами in vitro. 126
4.2.3. Определение доли гиподиплоидных клеток. 126
4.2.4. Выявление апоптотических клеток методом TUNEL. 127
4.2.5. Выявление апоптозн ых клеток методом прижизненного двойного окрашивания Аннексином V-FITC и PI 127
4.2.6. Проточная цитофлюориметрия. 128
4.2.7. МТТ- тест пролиферативнойактивности клеток 128
4.2.8. Определение половинной ингибирующей концентрации (ІС50) противоопухолевых препаратов и цитотоксинов 129
4.2.9. Получение F(ab)2 фрагментовМКА. 130
4.2.10. Иммуноблоттинг 130
4.2.11. Определение активации каспазы-3. 131
4.2.12. Конкурентная гибридизация кДНК на экспрессионных ДНК- микрочипах. 131
4.2.13. Анализ протеинового профиля 132
4.2.14. Световая светлополъная и фазовоконтрастнаямикроскопия. 132
4.2.15. Флюоресцентная микроскопия. 133
4.2.16. Изготовление иммуномагнитного анти-Fas препарата 133
Глава 5. Рецепторно-лигандный и лекарственно-индуцированный апоптоз. 135
5.1. Характеристика методов регистрации апоптоза. 135
5.1.1. Гиподиплоидные клетки 135
5.1.2. Регистрация накопления нитевых разрывов ДНК (TUNEL) 138
5.1.3. Флиппинг фосфатидилсерина клеточной мембраны 139
5.1.4. Сопоставление результатов оценки субпопуляции погибающих клеток, полученных разными методами. 144
5.2. Индукция апоптоза МКА aHmu-CD95, TRAIL и противоопухолевыми препаратами. 145
5.3. Блокирование лекарственно-индуцированного апоптоза F(ab)2 фрагментами aumu-CD95. 149
5.4. Экспрессия CD95L на поверхности клеток Jurkat после инкубации с противоопухолевыми препаратами 152
Глава 6. Получение С095-негативных клеточных линий. 154
6.1. Деплеция СБ95-позитивной популяции Т-лимфобластных клеток 154
6.2. Лекарственная индукция апоптоза клеток линии Jurkat/wt и А4. 160
Глава 7. Сравнительные характеристики клеток двух родственных линий. 168
7.1. Сравнительный анализ транскрипционной активности генома клеток обеих линий 168
7.2. Регуляция экспрессии отдельных генов при рецепторно-лигандной индукции апоптоза. 178
7.3. Протеомный профиль клеток обеих линий. 181
7.4. Состояние про-и антиапоптогенных сигнальных путей в клетках двух линий . 183
7.5. Возможная роль CD73 в антиапоптогенной программе клеток линии А4. 186
Глава 8. Лекарственная чувствительность двух родственных клеточных линий in vitro.
8.1. Сравнительные спектры чувствительности клеток к противоопухолевым лекарственным средствам. 191
8.2. Анализ клеточных популяций двух линий, переживших цитотоксическую терапию. 192
8.3. Возможные причины расхождений результатов оценки цитотоксической эффективности. 206
Часть III. Обсуждение результатов исследования. 211
Заключение 231
Выводы 236
Список цитированной литературы 239
