Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Пространственная организация днк в ядре 8
1.1.1. Уровни компактизации ДНК 8
1.1.2. Доменная структура генома 14
1.1.2.1. Ядерный матрикс 15
1.1.2.2. Прикрепленная к ядерному матриксу ДНК 16
1.1.2.3. Функции ДНК ядерного матрикса 19
1.1.3. Хромосомные территории 23
1.2. Незаконная рекомбинация и хромосомные перестройки 28
1.2.1. Двухчепочечные разрывы ДНК (ДЦР) и их репарация 28
1.2.2. Кластеризация точек разрыва при транслокациях, ассоциированных с лейкозами 34
1.2.3. Структура хроматина как причина кластеризации первичных точек разрыва 36
1.2.4. Участие топоизомеразы II в незаконной рекомбинации 37
1.2.5. Пространственная организация ядра способствует образованию определённых транслокаций 39
Постановка задачи и методические подходы 41
2. Материалы и методы 43
2.1. Материалы 43
2.1.1. Клеточные линии 43
2.1.2. Антитела 43
2.1.3. Химические реактивы 44
2.2. Методы 45
2.2.1. Культивирование человеческих клеток 45
2.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле 45
2.2.3. Приготовление препаратов ядерных матриксов in situ 46
2.2.4. Иммуноцитохшшя 47
2.2.5. Определение относительной представленности различных участков ДНК во фракции ДНК ядерного матрикса 47
2.2.6. Метод остановки полимеразной цепной реакции (PCR-stop assay) 48
2.2.7. Иммунопреципитация хроматина 50
2.2.7.1. Растворы: 50
2.2.7.2. Методика 51
3. Результаты исследований 54
3.1. Подавление активности днк-топоизомеразы ii приводит к образованию двухцепочечных разрывов ДНК 54
3.1.1. Обработка клеток этопозидом приводит к образованию ДЦР . 54
3.1.2. Количество ДЦР зависит от концентрации этопозида 57
3.1.3. Индуцированные monollДЦР эффективно репарируются 57
3.2. Роль ядерного матрикса в репарации дцр, индуцированных ДНК-топоизомеразой 60
3.2.1. Индуцированные этопозидом фокусы гистона уН2АХассоциированы с ядерным матриксом 60
3.2.2. Участки кластеризации то чек разрыва (Ьсг) ассоциированы с ядерным матриксом 64
3.3. Негомологичное соединение концов днк, как механизм хромосомных перестроек, индуцированных ДНК-топоизомеразой
3.3.1. Цитологический подход 66
3.3.2. Молекулярно-биологический подход 69
3.3.2.1. Выбор геномной модели 693.3.2.2. Контрольные эксперименты 71
3.3.2.3. Иммунопреципитация хроматина 74
4. Обсуждение результатов 77
Выводы 83
Список литературы
