Введение
РАЗДЕЛ 1. ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ (Обзор литературы)
Введение
Глава I. ААА+-белки
1.1. Строение и классификация AAA -белков
1.2. ААА-АТР-азы и контроль качества внутриклеточных белков
1.2.1. Шапероновые системы бактерии
1.2.2. Широкая специфичность и высокая селективность AAA-AT?-аз
1.2.3. Адапториые белки
Глава 2. Протеолитические системы, осуществляющие селективную деградацию внутриклеточных белков
2.1. АТР-зависимая деградация белков у эубактерий
2.2. АТР-зависимая деградация белков у эукариот
2.3. АТР-зависимая деградация белков в архебактериях
2.4. Общие характеристики функционирования эиергозависимых нротеиназ и протеолитических комплексов
2.4.1. Общий моторный модуль ААА~-протеиназ
2.4.2. Связь между АТР-азными и петпидазными составляющими
AAA -протеиназ
2.4.3. Общая стратегия узнавания мишеней А ТР-зависимыми протеиназами
2.4.4. Катализ процесса механического разворачивания белков AAA -А ТР-азами
2.4.5. Энергетическая цена селективного протеолиза
2.4.6. Энергозависимое разрушение стабильных белковых комплексов
Заключение
РАЗДЕЛ 2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Escherichia coli (Результаты работы и их обсуждение)
Глава 1. Структурная характеристика Lon-протеиназы Е. coli
1.1. Доменное строение Lon-протеиназы
1.2. Протеолитические центры ферментов семейства Lon-нротеиназ
1.3. Подсемейства в семействе Lon-иротеиназ
1.4. Активные центры Lon-протеиназ и других пептидгидролаз с каталитической диадой Ser - Lys
1.5. Заключение
Глава 2. Закономерности функционирования нативной Lon-протеиназы Е. coli
2.1. АТР-азная активность Lon-протеиназы in vitro
2.1.L АТР-азная активность Lon-протеиназы и содержание ионов Mg^
2.1.2. Влияние аденозиндифосфата на АТР-азную активность Lon-протеиназы
2.13. Дополнительные центры связывают белкового субстрата в структуре Lon-протеиназы
2.1.4. Функциональное значение эффекта активации гидролиза АТР
Lon-протеиназой в присутствии белкового субстрата
2.1.5. Заключение
2.2. Активность протеолитических центров Lon-протеиназы in vitro
2.2.1. Выбор субстратов для исследования функционирования протео.їитических
центров Lon-протеиназы
2.2.2. Сравнительная характеристика гидролиза белковых и пептидных
субстратов Lon-протеиназой (в стандартных условиях)
2.2.3. Влияние нуклеотидов и ионов магния на функционирование тптидазных
центров Lon-протеиназы
2.2.4. Взаимовлияние субстратов протеолитических центров Lon-протеиназы
2.2.5. Заключение
Глава 3. Мутантные формы Lon-протеиназы и их характеристика
3.1. Мутантные формы Lon-протеиназы, несущие замены в ААА*-модуле
3.1.1. Получение мутантов Lon-протеиназы
3.1.2. Энзиматические свойства мутантних форм Lon-протеиназы in vitro
3.1.3. Функциональная активность мутантних форм Lon-протеиназы in vivo
3.1.4. Особенности функционирования мутантних форм Lon-протеиназы
3.2. Уникальные свойства мутанта Lon~K362Q
3.2.1. Влияние нуклеотидов и ионов магния на пептидазную активность
мутанта Lon-K362Q
3.2.2. Комплементация мутаций Lon-K362Q и Lpn-S679A
3.2.3. Олигомерное состояние Lon-протеиназы и мутанта Lon-K3 620
3.3. Заключение
Глава 4. Укороченные формы Lon-протеиназы и их характеристика 173
4.1. Получение укороченных и модифицированных форм Lon-протеиназы 173
4.1 Л. Рекомбинантныеукороченные формы Lon-протеиназы 173
4.1.2. Укороченные формы Lon-протеиназы, полученные ограниченным
протеолазом 174
4.2. Энзиматическая активность укороченных и модифицированных форм
Lon-протеиназы 175
4.2.1. АТР-азная и протеолшпическая активность укороченных и модифицированных форм Lon-протеиназы 178
4.2.2. Пептидазная активность укороченных и модифицированных форм
Lon-протеиназы 182
4.3. Заключение 185
Глава 5. Кристаллическая структура индивидуальных доменов
Lon-протеиназы 186
5.1. Описание структур протеолшпического и а-спиршшзованного доменов 186
5.2. Олигомерное строение протеолитического домена Lon-протеиназы 191
5.3. Протеолитический центр Lon-протеиназы 193
5.4. Сопоставление протеолитического домена Lon-протеиназы Е. coli и ряда
протеиназ, имеющих каталитическую диаду Ser - Lys в активных центрах ] 96
5.5. Различия в связывании субстратов Lon-протеиназой и сериновыми протеиназами, имеющими в активном центре триаду Ser-His(Glu)-Asp 200
5.6. Заключение 202
Перспективные направления в исследовании протеиназ семейства
Lon (заключение) 203
РАЗДЕЛ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 205
3.1. Материалы 205
3.1.1. Реактивы 205
3.1.2. Ферменты 206
3.1.3. Штаммы Е. coli 206
3.2. Методы _ 206
3.2.1. Сопоставление аминокислотных последовательностей белков 206
3.2.2. Процедуры, использованные при работе с клетками 206
3.2.3. Сайт-направленный мутагенез гена ton 207
3.2.4. Выделение и очистка Lon-протеиназы, ее мутантных и укороченных форм 207
3.2.5. Ограниченный протеолнз Lon-протеиназы и ее мутантных форм. Выделение фрагментов фермента 209
3.2.6. Исследование смешанных олигомеров Lon-протеиназы 211
3.2.7. Тестирование ферментативной активности 211
3.2.8. Исследование олигомерного состояния натавной Lon-протеиназы 214
3.2.9. Кристаллизация индивидуальных доменов Lon-протеиназы 215
ВЫВОДЫ 216
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 219
ПРИЛОЖЕНИЕ 247
Источники Lon-протеиназ 248
Индексы последовательностей Lon-протеиназ в базе данных MEROPS 249
Сопоставление первичных структур LonA-протеиназ (табл. А1-А9) 250
Сопоставление первичных структур LonB-протеиназ (табл. В1-В7) 274
