Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Характеристика различных форм симбиоза 15
1.2. Бактерии Wolbachia – эндосимбионты членистоногих и нематод 17
1.2.1. Ультраструктурная организация бактерий Wolbachia 18
1.2.2. Филогения бактерий Wolbachia 19
1.2.3. Распределение бактерий Wolbachia в тканях хозяина 23
1.2.4. Действие Wolbachia на организм хозяина 26
1.2.4.1. Репродуктивные модификации, вызываемые Wolbachia в организме хозяина 28
1.2.4.2. Влияние Wolbachia на жизнеспособность хозяина 35
1.2.4.3. Влияние бактерий Wolbachia штамма wMelPop на продолжительность жизни D. melanogaster 38
1.3. Drosophila – удобный объект для исследования взаимодействия Wolbachia с
организмом хозяина 39
1.3.1. Строение мозга Drosophila melanogaster 40
1.4. Влияние неблагоприятных факторов среды на взаимоотношение эндосимбионта и хозяина 42
1.4.1. Действие повышенных и пониженных температур на систему эндосимбионт – хозяин 44
1.4.2. Влияние повышенных и пониженных температур на взаимоотношение эндосимбионта и хозяина 47
Заключение 49
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1. Характеристика использованных в работе лабораторных линий мух,
температурные режимы их содержания и схемы популяционных экспериментов 50
2.2. Список использованных реактивов 53
2.3. Молекулярно-биологические методы 53
2.3.1. Выделение геномной ДНК из дрозофилы 53
2.3.2. Условия полимеразной цепной реакции для определения наличия бактерий в организме D. melanogaster 54
2.3.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 55
2.3.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля и определение их нуклеотидной последовательности 55
2.4. Электронная микроскопия 56
2.4.1. Фиксация и заливка образцов мозга D. melanogaster для электронной микроскопии 56
2.4.2. Получение, окрашивание и исследование полутонких и ультратонких срезов 58
2.5. Конфокальная микроскопия 58
2.5.1. Фиксация и флуоресцентная гибридизация in situ образцов мозга D. melanogaster 58
2.5.2. Подсчёт относительной плотности и количества бактерий Wolbachia в
клетках мозга D. melanogaster с помощью программы ImageJ 60
2.5.2.1. Измерение плотности бактерий относительно всей площади мозга 60
2.5.2.2. Измерение количества бактерий в единичной клетке мозга 61
2.6. Статистические методы 61
Глава 3. Результаты 63
3.1. Молекулярно-биологический анализ инфицированности линий w1118 и w1118T
D. melanogaster бактериями Wolbachia штамма wMelPop 63
3.2. Популяционный анализ продолжительности жизни и выживаемости линии D. melanogaster, не инфицированной и инфицированной Wolbachia штамма wMelPop при различных температурных режимах 64
3.2.1. Сравнительный анализ средней продолжительности жизни и выживаемости инфицированной и не инфицированной Wolbachia штамма wMelPop линий D. melanogaster, содержащихся постоянно при 25 С, 29 С и 16 С 64
3.2.2. Сравнительный анализ средней продолжительности жизни и выживаемости инфицированной и не инфицированной Wolbachia штамма wMelPop линии
D. melanogaster, при содержании мух в течение 3, 7 и 13 суток при повышенной температуре (29 С) и последующем их переносе на пониженную температуру (16 С) 66
3.3. Исследование структурной организации и распределения симбиотических бактерий Wolbachia в клетках мозга D. melanogaster при различных температурных режимах с помощью электронной микроскопии 69
3.3.1. Морфология клеток мозга самок D. melanogaster 69
3.3.2. Ультраструктура и распределение Wolbachia в клетках мозга самок D. melanogaster, содержащихся при 25 С 72
3.3.3. Ультраструктура и распределение Wolbachia в ткани мозга самок D. melanogaster, содержащихся при повышенной температуре (29 С) 73
3.3.4. Исследование ультраструктуры и распределения Wolbachia в ткани мозга D. melanogaster при пониженной температуре (16 С) 74
3.3.5. Распределение Wolbachia в клетках мозга D. melanogaster при содержании мух на повышенной температуре (29 С) и последующем их переносе на пониженную (16 С) температуру 75
3.3.6. Гетерогенность морфологических типов бактерий и частота их встречаемости в клетках мозга мух, содержащихся при различных температурных режимах 77
3.4. Распределение симбиотических бактерий Wolbachia в клетках мозга D. melanogaster на разных стадиях жизненного цикла при 25 С и 29 С, исследованное с помощью конфокальной микроскопии 80
3.4.1. Детекция Wolbachia штамма wMelPop в клетках центральной нервной системы D. melanogaster 80
3.4.2. Распределение и титр бактерий Wolbachia в клетках центральной нервной системы личинок 3-го возраста D. melanogaster при 25 С и 29 С 81
3.4.3. Распределение и титр бактерий Wolbachia в клетках мозга взрослых мух при 25 С и 29 С 83
3.4.4. Сравнительный анализ плотности Wolbachia в центральной нервной системе личинок 3-го возраста и мозга взрослых мух, содержащихся при 25 С и 29 С на основании данных флуоресцентной гибридизации in situ 85
3.4.5. Сравнительный анализ плотности Wolbachia в клетках мозга куколок D. melanogaster, содержащихся при 25 С и 29 С на основании данных флуоресцентной гибридизации in situ 87
ГЛАВА 4. Обсуждение 89
4.1. Особенности взаимоотношений внутри ассоциации Wolbachia- D. melanogaster в условиях повышенной и пониженной температуры 89
4.1.1. Влияние повышенной и пониженной температуры на организм D. melanogaster 89
4.1.2. Влияние повышенной и пониженной температуры на жизнеспособность Wolbachia 93
4.1.3. Влияние повышенной и пониженной температуры на взаимодействие партнеров в симбиотической системе Wolbachia-D. melanogaster 96
4.2. Возможные пути деградации бактерий Wolbachia штамма wMelPop в клетках мозга D. melanogaster. Гибель бактерий как один из главных факторов, снижающих, продолжительность жизни D. melanogaster 98
4.3. Влияние повышенной температуры на титр бактерий Wolbachia в клетках мозга D. melanogaster проявляется начиная со стадии «поздней» куколки 102
4.4. Особенности распределения Wolbachia штамма wMelPop на разных стадиях,
жизненного цикла D. melanogaster 104
Заключение 110
Выводы 111
Литература 113
