СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................. 5
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ..................................................................... 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................. 13
1.1. Патогенные бактерии Staphylococcus aureus ....................................................... 13
1.1.1. Эпидемиология представителей рода Staphylococcus ................................................ 13
1.1.2. Борьба с биопленками ................................................................................................... 14
1.2. NAD(P)+-зависимая формиатдегидрогеназа ........................................................ 15
1.2.1. Общие сведения о формиатдегидрогеназе .................................................................. 15
1.2.2. Физиологическая роль и применение формиатдегидрогеназ .................................... 16
1.2.3. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей
формиатдегидрогеназ .............................................................................................................. 20
1.2.4. Трехмерная структура и механизм действия .............................................................. 32
1.3. Свойства формиатдегидрогеназ из различных источников ............................... 38
1.3.1. Каталитические параметры формиатдегидрогеназ .................................................... 38
1.3.2. Термостабильность ........................................................................................................ 39
1.3.3. Влияние реакционной среды на каталитические свойства формиатдегидрогеназ . 39
1.4. Белковая инженерия формиатдегидрогеназ ......................................................... 42
1.4.1. Увеличение термо- и химической стабильности ........................................................ 42
1.4.2. Изменение каталитических свойств и коферментной специфичности .................... 47
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................................... 51
2.1. Материалы ............................................................................................................... 51
2.2. Методы исследования ............................................................................................ 53
2.2.1. Поиск последовательностей в базах данных .............................................................. 53
2.2.2. Компьютерное моделирование трехмерных структур ............................................... 53
2.2.3. Направленный мутагенез .............................................................................................. 53
2.2.4. ДНК-электрофорез в агарозном геле ........................................................................... 54
2.2.5. Рестрикция фрагментов ДНК ....................................................................................... 55
2.2.6. Приготовление компетентных клеток E. coli .............................................................. 55
2.2.7. Лигирование ................................................................................................................... 55
2.2.8. Трансформация клеток E. coli и клонирование .......................................................... 56
2.2.9. Выделение плазмидной ДНК ........................................................................................ 56
2.2.10. Секвенирование ДНК .................................................................................................. 56
3
2.2.11. Экспрессия мутантных форм SauФДГ в клетках E. coli .......................................... 57
2.2.12. Трансформация клеток Е. сoli BL21 (DE3)CodonPlus/pLysS для получения
штамма-продуцента ................................................................................................................. 57
2.2.13. Культивирование клеток E. coli и создание музейной культуры ........................... 57
2.2.14. Выделение и очистка SauФДГ .................................................................................... 58
2.2.15. Хроматографическая очистка фермента ................................................................... 59
2.2.16. Диализ ........................................................................................................................... 60
2.2.17. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях ............................................ 60
2.2.18. Определение активности ФДГ.................................................................................... 61
2.2.19. Определение констант Михаэлиса ............................................................................. 61
2.2.20. Определение концентрации белка по методу Бредфорда и определение
каталитической константы ...................................................................................................... 61
2.2.21. Определение констант скорости термоинактивации ............................................... 62
2.2.22. Определение активационных параметров термоинактивации
формиатдегидрогеназы ........................................................................................................... 63
2.2.23. Измерение ЯМР спектров ........................................................................................... 63
3.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .............................................................................. 64
3.1. Изучение влияния N-концевой последовательности на уровень экспрессии и
свойства рекомбинантной SauФДГ .............................................................................. 64
3.2. Исследование влияния состава и концентрации компонентов буферных систем на
каталитические свойства SauФДГ ................................................................................ 72
3.2.1. Определение каталитических параметров .................................................................. 73
3.3. Белковая инженерия формиатдегидрогеназы из S. aureus ................................. 76
3.3.1. Влияние консервативного мотива X1G(A)X2GRX3G на свойства фермента ........... 76
3.3.2. Изучение X1DX2, ответственного за коферментную специфичность ...................... 84
3.3.3. Изучение структуры активного центра методом направленного мутагенеза ......... 89
3.3.4. Белковая инженерия С-концевой последовательности формиатдегидрогеназ ....... 95
3.4. Исследование SauФДГ методом ЯМР ................................................................ 104
3.4.1. Оптимизация условий экспрессии SauФДГ .............................................................. 106
3.4.2. Получение изотопно-меченых образцов SauФДГ .................................................... 109
3.4.3. Пробоподготовка образцов и измерение ЯМР спектров ......................................... 111
3.4.4. Исследование структуры SauФДГ методом ЯМР .................................................... 112
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................ 114
4
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................... 116
