Введение
1. Введение 4
2. Обзор литературы 6
2.1. Т- клеточный иммунитет и репертуар TCR 6
2.1.1. Развитие Т-лимфоцитов в тимусе 6
2.1.2. Генерация TCR 9
2.1.3. Участие аВ Т-лимфоцитов в адаптивном иммунном ответе 13
2.1.4. Взаимодействие TCR и МНС 15
2.1.5. Разнообразие репертуарові^ 16
2.1.6. Общественные TCR клонотипы 17
2.1.7. Старение Т-клеточного иммунитета человека 20
2.2. Методы исследования разнообразия индивидуальных репертуарові-клеточных
рецепторов 23
2.2.1. Проточная цитометрия 23
2.2.2. Спектротипирование 23
2.2.3. Гибридизация 26
2.2.4. Секвенирование нуклеотидных последовательностей Т- клеточных рецепторов
26
2.2.5. Ошибки ПЦР и секвенирования - искусственное разнообразие 32
CLASS3. Цели и задачи 35CLASS
4. Материалы и методы 36
4.1. Оборудование и расходные материалы 36
4.2. Реактивы 36
4.3. Методы 38
4.3.1. Сбор образцов 38
4.3.2. Выделение РВМС 38
4.3.3. Выделение тотальной РНК из клеток 39
4.3.4. Синтез кДНК 39
4.3.5. Первый раунд ПЦР-амплификации 40
4.3.6. Второй раунд ПЦР-амплификации 41
4.3.7. Секвенирование 42
4.3.8. Анализ результатов массированного секвенирования 43
4.3.9. Расчет дивергенции Дженсена - Шеннона между распределениями VB-
сегментов 43
4.3.10. Оценка нижней границы разнообразия репертуара CDR3 TCRp периферической крови 44
4.3.11. Проточная цитометрия 44
4.3.12. HLA-типирование 45
5. Результаты и их обсуждение 46
5.1. Сравнительный анализ репертуаров TCRP мам и детей 46
5.1.1. Распределение частот использования Vp сегментов 47
5.1.2. Пересечения репертуаров TCRp CDR3 в родственных и неродственных парах мама-ребенок 56
5.1.3. Одинаковые аминокислотные последовательности CDR3 чаще сочетаются с одинаковым Vp-сегментом в родных парах доноров 58
5.1.4. Селекция в тимусе снижает среднюю длину CDR3 60
5.1.5. В поисках зрелых микрохимерных клонов Т-клеток 61
5.1.6. Оценка пересечения полных индивидуальных TCRp репертуаров 66
5.2. Разработка метода нормированного анализа репертуаров TCR с использованием молекулярного баркодирования 70
5.3. Исследование изменений репертуара TCRp в ходе старения человека 75
5.3.1. Индивидуальное разнообразие TCRp CDR3 падает в течение всей жизни человека 75
5.3.2. Определение нижней границы индивидуального разнообразия TCRp CDR3 79
5.3.3. Заполнение гомеостатического пространства активированными клонами Т-клеток 81
5.3.4. Корреляция между разнообразием TCRp и долей наивных Т- клеток в периферической крови 82
5.3.5. Образцы периферической крови долгоживущих доноров характеризуются высоким содержанием CD4+ наивных Т- клеток 85
5.3.6. Возрастные изменения относительной представленности Vp- и jp-сегментов 86
5.3.7. Общественные клонотипы и старение 88
6. Выводы 91
7. Заключение 93
8. Список сокращений 94
9. Список литературы 96
