Введение
Обзор литературы 9
1. Инициация транскрипции вЕ.соїі 10
1.1. Структура РНК-полимеразы. Разнообразие а-субъединиц и их роль в регуляции экспрессии генов 10
1.2. Основные стадии процесса инициации транскрипции 12
1.3. Элементы структуры промоторов, узнаваемых Ест70 14
1.4. Регуляция промоторов, узнаваемых Ес70 19
1.5. Промотор лактозного оперона 21
2. Современные методы конструирования бесплазмидных штаммов-продуцентов 27
2.1. Гомологичная рекомбинация в Е.coli 29
2.2. Интеграция линейных молекул ДНК в гесП и гесВС sbcBC штаммах E.coli 32
2.3. Методы интеграции линейных молекул ДНК в хромосому штамма дикого типа 35
2.4. Использование плазмидной интеграции для введения мутаций в хромосому E.coli 36
2.5. Red- и RecET-зависимая интеграция линейных молекул ДНК 39
2.6. Использование систем сайт-специфической рекомбинации для интеграции, клонирования фрагментов ДНК и удаления генетических маркеров 48
Материалы и методы 55
Бактериальные штаммы, плазмидные и фаговые ДНК 55
Генно-инженерные методики 56
Проведение полимеразной цепной реакции 57
Оценка силы промоторов по устойчивости клеток к хлорамфениколу.Определение активности (3-галактозидазы в экстрактах бактериальных клеток 57
Электрофорез клеточных белков 58
Mu-зависимая интеграция промотора Рь-tac 58
Р1-трансдукция 59
Интеграция линейной ДНК в хромосому штамма E.coli recBCsbcBC...60
Электротрансформация клеток E.coli 61
Red-зависимая интеграция линейных фрагментов ДНК 61
Удаление антибиотического маркера из хромосомы E.coli К12 с
использованием функций Int/Xis фага X 62
Результаты и обсуждение 63
1. Клонирование известных и создание новых регуляторных элементов E.coli и
исследование их свойств 63
1.1. Создание вектора для клонирования промоторов 63
1.2. Клонирование промоторов, узнаваемых РНК полимеразой (Еа70) E.coli, и оценка их силы 65
1.3. Молекулярное клонирование и оценка относительной эффективности р-независимых терминаторов транскрипции - terjhrL и ter rrnB 67
1.4. Конструирование новых промоторов и исследование их свойств 70
1.4.1. ПрОМОТОрЫ Ptoc-ideal И Pfrc-ideal 70
Конструирование гибридных промоторно-операторных элементов .71
Исследование свойств новых промоторов 72
1.4.2. Промотор PL-/0C 83
1.5. Создание плазмид-помощников pACYCPiaclacI и PACYCPLCIIS 85
2. Создание и использование удобных интегративных систем 87
2.1. Удаление генетического маркера с использованием функций Int и Xis фага Я 87
2.2. Получение немаркированных делеций с использованием продуктов генов Red-системы и int/xis бактериофага А, 92
2.3. Модификация нативной регуляторной области целевого гена в бактериальной хромосоме с использованием раз Int/Xis-Red-зависимой системы 96
2.3.1. Замена нативной регуляторной области на известный прокариотический промотор 97
2.3.2. Оптимизация экспрессии целевого хромосомального гена путем использования синтетического промотора с вырожденной последовательностью области «-35» 99 Определение коэффициента репрессии новых промоторов, полученных в результате варьирования области «-35» промотора Р/ас .104
Выводы 107
Список цитируемой литературы 108
