Введение
2. Обзор литературы 19
2.1 Эпизоотическая обстановка по особо опасным зооантропонозным болезням, вызываемых представителями порядка Mononegavirales 19
2.2 Характеристика вирусов - отдельных представителей семейств Orthomixoviridae, Paramixoviridae и Bunjaviridae порядка Mononegaviralesи 20
2.2.1 Характеристика вируса гриппа А 23
2.2.2 Характеристика вируса болезни Ньюкасла 26
2.2.3 Характеристика вируса лихорадки долины Рифт 28
2.2.4 Реассортация РНК содержащих вирусов,имеющих сегментированный геном 38
2.3 Диагностика особо опасных инфекций 40
2.3.1 Диагностика гриппа птиц, болезни Ньюкасла 41
2.3.2 Диагностика лихорадки долины Рифт 41
2.4 Использование рекомбинантных белков в качестве специфических антигенов 44
2.5 Гибридомная технология и применение моноклональных антител 45
2.6 Противовирусный и поствакцинальный иммунитет 49
2.6.1 Особенности иммунного ответа при ДНК-иммунизации 52
2.7 Методы повышения иммуногенности вакцинных препаратов 55
2.8 История создания средств специфической профилактика лихорадки долины Рифт 57
2.9 Стратегия контроля лихорадки долины Рифт, гриппа птиц, болезни Ньюкасла 63
2.10 Заключение к обзору литературы 66
3. Собственные исследования 68
3.1 Материалы и методы 68
3.1.1 Материалы 68
3.1.1.1 Вирусы, антигены, сыворотки 68
3. 1.1.2 Животные 69
3. 1.1.3 Культуры клеток з
3. 1.1.4 Гибридомы 69
3.1.1.5 Рекомбинантные плазмиды и рекомбинантные белки 70
3. 1.1.6 Питательные среды, добавки к ним, ферменты, соли 70
3. 1.1.7 Оборудование 71
3. 1.2 Методы 71
3.1.2.1 Получение культурального вируссодержащего материала 71
3.1.2.2 Определение концентрации белка 72
3.1.2.3 Иммунизация мышей 72
3.1.2.4. Базовый протокол получения моноклональных антител 72
3.1.2.5 Скрининг гибридных антителопродуцентов 72
3.1.2.6 Изучение иммунохимических свойств МКА 74
3.1.2.7 Микровариант реакции нетрализации 76
3.1.2.8 Конъюгирование МКА с пероксидазой хрена 76
3.1.2.9 Сэндвич-вариант ТФ ИФА для выявления антигенов 76
3.1.2.10 Определение функциональных свойств ТФ ИФА 77
3.1.2.11 Определение иммунного статуса и цитокинового профиля 77
3.1.2.12 Нуклеотидное секвенирование и выравнивание нуклеотидных последовательностей 78
3.2.13 Методы математического анализа 78
4. Результаты собственных исследований 79
4.1 Соверешенствование технологии получения антител узкой направленности на основе использования ДНК-конструкций и рекомбинантных белков 79
4.1.1 Изучение антигенных свойств рекомбинантных плазмид и рекомбинантных белков 79
4.1.2 Получение и характеристика моноспецифических сывороток на основе использования ДНК-конструкций и рекомбинантных белков 81
4.1.3 Совершенствование технологии получения моноклональных антител и их харатеристика 88
4.2 Разработка методов ранней диагностики лихорадки долины Рифт, гриппа птиц и болезнь Ньюкасла 104
4.2.1 Методы молекулярной диагностики для выявления генома вирусов ЛДР и гриппа птиц Н5N1 104
4.2.2 Использование МКА и рекомбинантных белков для 108
индикации и идентификации антигенов вирусов лихорадки долины Рифт, гриппа птиц и болезни Ньюкасла
4.2.2.1 Разработка метода иммуноцитохимического анализа для обнаружения возбудителей лихорадки долины Рифт, гриппа и птиц, болезни Ньюкасла 109
4.2.2.2 Разработка тест-системы на основе моноклональных антител для идентификации и дифференциации гриппа птиц и болезни Ньюкасла 118
4.2.2.2.1 Разработка двухсайтового ТФ ИФА на основе моноклональных антител для идентификации вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла 118
4.2.2.2.2. Изучение активности и специфичности «Набора препаратов на основе моноклональных антител к нуклеопротеину для идентификации и дифференциации гриппа птиц и болезни Ньюкасла» 128
4.2.2.3. Выявление пероксидазы хрена в качестве активной метки методом иммунохемилюминесцентного анализа 132
4.2.3 Разработка средств серологического мониторинга гриппа птиц, болезни Ньюкасла и лихорадки долины Рифт 135
4.2.3.1 Разработка непрямого ТФ ИФА для выявления специфических антител к вирусам гриппа птиц и болезни Ньюкасла 135
4.2.3.2 Сравнительное изучение чувствительности и специфичности методов ТФ ИФА для выявления антител к вирусам гриппа птиц и болезни Ньюкасла 143
4.2.3.3 Разработка непрямого ТФ ИФА на основе рекомбинантных белков для выявления специфических антител к вирусу ЛДР 150
4.3 Современные подходы создания эффективных безопасных вакцин и стратегии вакцинации против особо опасных инфекций (на примере гриппа птиц подтипа Н5 и лихорадки долины Рифт) 157
4.3.1 Обоснование выбора штамма вируса лихорадки долины Рифт 157
4.3.1.1 Иммунобиологические свойства штаммов вируса лихорадки долины Рифт 157
4.3.1.2 Культуральные свойства вируса лихорадки долины Рифт 159
4.3.1.3 Молекулярная характеристика штамма «1974-ВНИИВВиМ» 166
4.3.1.4 Устойчивость вируса лихорадки долины Рифт штамм 172
«1974-ВНИИВВиМ» к действию инактивантов 4.3.1.5 Разработка лабораторных методов контроля вирусного сырья и инактивированного антигена вируса лихорадки долины Рифт 176
4.3.1.5.1 Подбор лабораторной модели для контроля безвредности, антигенности и иммуногенности препаратов инактивированного антигена вируса лихорадки долины Рифт 176
4.3.1.5.2 Разработка тест-систем для контроля накопления протективных антигенов вируса лихорадки долины Рифт 179
4.3.2 Разработка оптимальных стратегий вакцинации против гриппа птиц пятого подтипа и лихорадки долины Рифт 187
4.3.2.1 Эффективность гомологичной прайм-бустерной иммунизации на основе инактивированного антигена вируса ЛДР 187
4.3.2.2. Эффективность гомологичной прайм-бустерной ДНК-иммунизации против гриппа птиц пятого подтипа 191
4.3.2.3. Эффективность гомологичной прайм-бустерной ДНК-иммунизации против лихорадки долины Рифт 197
4.3.2.4. Эффективность воздействия различных систем доставки иммуногена на развитие иммунного ответа против лихорадки долины Рифт 205
4.4. Схема обеспечения готовности противодействия в случае угрозы возникновения (заноса) лихорадки долины Рифт 213
5. Обсуждение 217
6. Выводы 234
7. Практические предложения 237
8. Список литературы 239
