Введение
Обзор литературы .11
1. Corynebacterium glutamicum - важный объект биотехнологического производства 11
1.1.Общая характеристика Corynebacterium glutamicum .11
1.2. Центральный метаболизм углерода и пути биосинтеза основных продуктов биотехнологии 13
1.3. Современные подходы рационального дизайна продуцентов С. glutamicum 18
1.4. Основные продукты, получаемые с использованием C. glutamicum, и перспективы использования этого микроорганизма в биотехнологии 25
1.5. Генетические методы для метаболической инженерии C. glutamicum 27
2. Бактериофаг Mu – транспозон 37
2.1. Необходимые для транспозиции ДНК элементы фага Mu 39
2.2. Белки, принимающие участие в репликативной транспозиции бактериофага Mu 41
2.3. Реконструкция моделей транспозосом 45
2.4. Стадии репликативной транспозиции фага Mu 46
2.5. Механизм нерепликативной транспозиции фага Mu 50
2.6. Бактериофаг Mu – инструмент генной инженерии 52
Материалы и методы .57
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования 57
2. Олигонуклеотиды .60
3. Cтандартные генно-инженерные методики 63
4. Электротрансформация клеток C. glutamicum 64
5. Электротрансформация клеток M. methylotrophus AS1 (M. extorquens AM1) 64
6. Интеграция mini-Mu транспозона в хромосому C.glutamicum 65
7. Интеграцияmini-MuтранспозонавхромосомуM. methylotrophus AS1 (M. extorquens AM1) .66
8. Внутрихромосомальная амплификация mini-Mu (LER) единицы в клетках C. glutamicum .66
9. Внутрихромосомальная амплификация mini-Mu(LER) единицы в клетках M. methylotrophusAS1 66
10. Вырезание ДНК фрагмента, заключенного между lox сайтами, из mini-Mu единиц, интегрированных в геном C. glutamicum 67
11. Вырезание ДНК фрагмента, заключенного между lox сайтами, из mini-Mu единиц, интегрированных в геномM. methylotrophus AS1 67
12. Гибридизация по Саузерну 67
13. Измерение относительной флуоресценции .68
14. Определение точек интеграции mini-Mu транспозона в хромосоме C. glutamicum 68
15. «Shotgun» клонирование интегрированных в хромосому C. glutamicum копий mini-Mu единиц 69
16. Конструирование рекомбинантных плазмид 70
16.1. Конструирования хелперной плазмиды pVK9- lacIQ-Ptac-MuAB 70
16.2. Конструирования хелперной плазмиды pVK-Pdap-MuAB 70
16.3. Конструирование интегративной плазмиды pAH-mini-Mu(LR)-YK 71
16.4 Конструирование интегративных плазмид pAH-mini-Mu(LER)-YK, pAH-mini-Mu(L R)-YK 73
16.5. Конструирование интегративной плазмиды pAH-mini-Mu(LER)-GK 73
16.6. Конструирования плазмиды pCM110-GmR 73
16.7. Конструирование хелперной плазмиды pT-Plac-cre 73
16.8. Конструирование хелперной плазмиды p06-PdapA-cre 74
Результаты и обсуждение .75
1. Адаптация системы транспозиции бактериофага Mu для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому C. glutamicum ATCC 13869 75
1.1. Компоненты Mu-зависимой системы интеграции/ амплификации/ фиксации генов в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 75
1.2. Транспозиция mini-Mu(LER) единицы с интегративной плазмиды, находящейся в суперскрученной форме, в хромосому C. glutamicum ATCC 13869 81
1.3. Влияние формы донорной ДНК и E-элемента на эффективность транспозиции mini-Mu единицы с интегративной плазмиды в хромосому C. glutamicum ATCC 13869 87
2. Амплификация mini-Mu(LER)-YK единицы в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869, оптимизация процесса 90
2.1. Исследование природы происхождения клона №10 90
2.2. Влияние уровня экспрессии факторов транспозиции на эффективность внутримолекулярного переноса mini-Mu единицы в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 93
2.3. Внутримолекулярная Mu-зависимая амплификация mini-Muединиц различного состава в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 96
3. Стратегия интеграция/амплификация/фиксация различных mini-Mu(LER) единиц в хромосоме C. glutamicum ATCC 13869 100
4. Универсальность метода Mu-зависимой транспозиции для С. glutamicum. Новый интегративный вектор 102
5. Метилотрофы – перспективный объект биотехнологии 107
5.1. Система интеграции/амплификации mini-Mu элементов в хромосоме Methylophilus methylotrophus AS1, разработанная ранее 107
5.2. Реализация стратегии интеграции/амплификации/фиксации различных mini-Mu(LER) единиц в геноме M. methylotrophus AS1 108
5.3. Адаптация системы транспозиции бактериофага Mu для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому M. extorquens AM1 111
Выводы .114
Список сокращений и условных обозначений .116
Список цитируемой литературы .117
Благодарности 134
