Введение
1 Основные факторы терминации трансляции 11
1.1 Общая схема терминации трансляции 11
1.2 Фактор терминации eRF1 12
1.3 Фактор терминации eRF3 14
1.4 Комплекс eRF1-eRF3 15
1.5 Факторы терминации в рибосоме 16
2 Дополнительные факторы терминации трансляции 22
2.1 ABCE1 22
2.2 PABP 22
2.3 eIF5A 24
2.4 Деацилированная тРНК 26
2.5 Dbp5 28
2.5.1 DEAD-box семейство хеликаз 28
2.5.2 Функция Dbp5 в транскрипции 32
2.5.3 Dbp5 как фактор экспорта мРНК 32
2.5.4 Роль Dbp5 в терминации трансляции дрожжей 35
2.6 GLE1 36
2.6.1 Структура Gle1 36
2.6.2 Gle1 в экспорте мРНК 39
2.6.3 Взаимодействие Dbp5 и Gle1 40
2.6.4 Функция Gle1 в трансляции дрожжей 44
2.6.5 Роль hGle1 в образовании стресс-гранул 46
2.6.6 Олигомеризация Gle1 48
2.6.7 Болезни, ассоциированные с Gle1 49
Материалы и методы 52
1 Материалы 52
1.1 Клетки, штаммы бактерий и плазмиды 52
1.2 Используемые среды 52
1.3 Используемые буферы и реактивы 52
1.4 Используемые антитела 53
1.5 Используемые ферменты 54
1.6 Используемые олигонуклеотиды 54
2 Методы 56
2.1 Полимеразная цепная реакция 56
2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле 56
2.3 Очистка фрагментов ДНК из агарозы 56
2.4 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 56
2.5 Лигирование ДНК 57
2.6 Трансформация E. coli плазмидной ДНК 57
2.7 Анализ клонов методом ПЦР-скрининга 58
2.8 Выделение плазмидной ДНК из E. coli 58
2.9 Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК 58
2.10 Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ 58
2.11 Вестерн-блот анализ 59
2.12 Выделение и очистка белков 59
2.12.1 Выделение и очистка компонентов реконструированной системы трансляции 59
2.12.2 Экспрессия и выделение DDX19 и его мутантов 59
2.12.3 Экспрессия и выделение Gle1 и eRF3a. 60
2.13 Получение мРНК in vitro 60
2.14 Сборка преТК 60
2.15 Toe-print анализ 61
2.16 Анализ гидролиза пептидил-тРНК 61
2.17 GTPазный тест 62
2.18 Pull down анализ 62
2.19 Связывание факторов с преТК 62
2.20 ATPазный тест 63
2.21 Статистическая обработка данных 63
Результаты и обсуждение 64
1 Участие DDX19 человека в терминации трансляции 64
1.1 Описание транскрипционных вариантов генов DDX19A и DDX19B 64
1.2 Белок DDX19 человека связан с полисомами 72
1.3 AMPPNP стимулирует связывание DDX19 с преТК 74
1.4 DDX19 стимулирует образование ТК 77
1.5 DDX19 увеличивает эффективность гидролиза пептидил-тРНК при терминации трансляции 81
1.6 DDX19 активирует терминацию трансляции во время распознавания стоп кодона 82
1.7 Мутантные формы DDX19 активируют терминацию трансляции 84
1.8 DDX19 стимулирует активность факторов элонгации трансляции в рибосоме 85
1.9 Модель функционирования DDX19 в трансляции 89
2 Участие GLE1 в терминации трансляции 90
2.1 Белок Gle1 человека связывается с полисомами 91
2.2 Получение изоформ Gle1 92
2.3 Разные изоформы hGle1 по-разному влияют на гидролиз пептидил-тРНК 93
2.4 Изоформы Gle1A и Gle1B по-разному связываются с рибосомными комплексами 94
2.5 Изоформы Gle1A и Gle1B по-разному влияют на формирование терминационных комплексов 97
2.6 Влияние мутаций С-конца Gle1 на активность в терминации трансляции 99
2.7 Gle1A и Gle1B не влияют на GTPазную активность eRF3 101
2.8 Разный уровень экспрессии мРНК Gle1B и Gle1A в клетках линии HEK293 NT 102
2.9 Уровень экспрессии мРНК Gle1A клетках линии HEK293 NT изменяется во время стресса 103
2.10 Модель функционирования Gle1 в терминации трансляции 105
3 Влияние коротких uORFs на эффективность трансляции у эукариот 106
3.1 uORFs 5 -НТО ингибируют трансляцию в лизате PKM мРНК. Влияние DDX19 и Gle1 на трансляцию uORFs 5 -НТО мРНК PKM 107
Заключение 110
Выводы 111
Благодарности 112
Список литературы 113
