Введение
Глава 1 Обзор литературы 20
1.1 Вирусы гриппа А и их эволюционная изменчивость 20
1.1.1. Классификация вирусов гриппа 20
1.1.2. Организация генома и сновные функции белков вируса гриппа А 21
1.1.3. Антигенная изменчивость вируса гриппа А 25
1.1.4. Потенциально-пандемические вирусы гриппа А 26
1.2 Современные вакцины для профилактики сезонного гриппа 31
1.2.1. Инактивированные гриппозные вакцины 32
1.2.2. Живые гриппозные вакцины 34
1.2.2.1. Лицензированные живые гриппозные вакцины 34
1.2.2.2. Основы аттенуации холодоадаптированных вакцинных штаммов ЖГВ 41
1.2.2.3. Культуральные живые гриппозные вакцины 43
1.2.3. Экспериментальные живые гриппозные вакцины 45
1.2.3.1. Экспериментальные холодоадаптированные живые гриппозные вакцины 45
1.2.3.2. Альтернативные подходы к созданию живых гриппозных вакцин 48
1.2.4. Критерии для лицензирования новых гриппозных вакцин для людей 49
1.3 Гриппозные вакцины против потенциально-пандемических вирусов гриппа 51
1.3.1. Вакцины против потенциально-пандемических вирусов гриппа H2N2 53
1.3.2. Вакцины против потенциально-пандемических вирусов гриппа H5N1 55
1.3.3. Вакцины против потенциально-пандемических вирусов гриппа H7N9 60
1.4 Подходы к созданию универсальной гриппозной вакцины 62
1.4.1. Подходы к индукции перекрестно-реагирующего гуморального иммунного ответа 63
1.4.2. Подходы к индукции перекрестно-реагирующего Т-клеточного иммунного ответа 68
1.5 Заключение к обзору литературы 72
Глава 2. Материалы и методы исследования 73
2.1 Материалы исследования 73
2.1.1 Клеточные линии 73
2.1.2 Вирусы 73
2.1.3 Плазмидные ДНК 74
2.1.4 Рекомбинантные белки и пептиды 75
2.1.5 Доноры 75
2.2. Методы исследования 76
2.2.1 Подготовка вакцинных штаммов с помощью классической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах. 76
2.2.2 Методы обратной генетики для конструирования генно-инженерных вирусов гриппа. 76
2.2.3 Методы оценки биологических свойств вирусов гриппа в опытах in vitro. 77
2.2.4 Методы работы с лабораторными животными. 78
2.2.5 Методы оценки иммунного ответа на живую гриппозную вакцину. 81
2.2.5.1. Системный гуморальный иммунный ответ 82
2.2.5.2. Локальный (секреторный) иммунный ответ 84
2.2.5.3. Т-клеточный иммунный ответ 84
2.2.6 Методы биоинформатики для анализа Т-клеточных эпитопов в составе вирусных белков. 84
2.2.7 Оценка кросс-реактивности Т-клеток человека к различным эпитопам нуклеопротеина in vitro. 85
2.2.7.1. Экспансия человеческих вирус-специфичных Т клеток in vitro 85
2.2.7.2. Перекрестная реактивность эпитоп-специфичных Т клеток 86
2.2.8 Клинические испытания живых гриппозных вакцин на добровольцах. 86
2.2.9 Методы статистического анализа результатов исследований 89
Глава 3. Разработка универсального донора для подготовки реассортантных вакцинных штаммов для живой и инактивированной гриппозных вакцин 90
3.1 Подготовка и характеристика альтернативного донора аттенуации и высокой репродуктивности для живых и инактивированных гриппозных вакцин. 90
3.2 Фенотипическая характеристика модифицированного донора аттенуации 59/М2 93
3.3 Чувствительность модифицированного донора аттенуации 59/М2 к химиопрепаратам адамантанового ряда 94
3.4 Аттенуирующие свойства модифицированного донора 59/М2 95
Глава 4. Молекулярно-генетическое обоснование безвредности и генетической стабильности живой гриппозной вакцины 96
4.1 Разработка обратно-генетической системы для отечественного донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) 96
4.1.1. Клонирование генов донора аттенуации Лен/17 в векторы для обратной генетики 96
4.1.2 Оценка биологических свойств вируса Лен/17-rg 97
4.2 Изучение роли мутаций донора Лен/17 в проявлении признака температурочувствительности 99
4.3 Определение ts мутаций, реверсия которых необходима для восстановления дикого фенотипа у вакцинного штамма ЖГВ 103
4.4 Изменение ts и att фенотипов антигенно неродственного вирулентного вируса при внесении в его геном ts мутаций, свойственных донору Лен/17 104
Глава 5. Подготовка, доклиническое и клиническое изучение живой гриппозной вакцины против потенциально пандемических вирусов гриппа A(H2N2) 108
5.1 Подготовка реассортантных вакцинных штаммов A(H2N2) с использованием новых подходов 108
5.2 Репликативные свойства вакцинных штаммов A(H2N2) in vitro и in vivo 111
5.3 Иммуногенность и защитная эффективность вакцинных штаммов H2N2 на модели мышей 113
5.4 Иммуногенность и защитная эффективность вакцинных штаммов H2N2 на модели хорьков 115
5.5 Клинические испытания живой гриппозной вакцины против потенциально-пандемического вируса A(H2N2) на добровольцах (I фаза). 121
5.5.1. Оценка реактогенности ЖГВ H2N2 на добровольцах 122
5.5.2. Оценка приживляемости, трансмиссивности и генетической стабильности ЖГВ H2N2 на добровольцах 123
5.5.3. Оценка иммуногенности ЖГВ H2N2 на добровольцах 125
Глава 6 Подготовка, доклиническое и клиническое изучение живой гриппозной вакцины против потенциально пандемических вирусов гриппа A(H7N9) 132
6.1 Подготовка вакцинного штамма ЖГВ из низкопатогенного вируса A(H7N9) методом классической реассортации и изучение его биологических свойств 132
6.2 Оценка влияния мутаций в молекуле гемагглютинина вакцинного штамма ЖГВ A(H7N9) на его основные биологические свойства 137
6.2.1. Рецепторная специфичность вакцинных штаммов ЖГВ H7N9 137
6.2.2. Инфекционная активность вакцинных штаммов ЖГВ H7N9 in vitro 137
6.2.3. Иммуногенность, кросс-реактивность и защитная эффективность вакцинных штаммов ЖГВ H7N9 для мышей линии BALB/c 138
6.3 Доклинические исследования вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) на модели хорьков 140
6.3.1. Оценка безвредности вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) на модели хорьков 140
6.3.2. Оценка иммуногенности и защитной эффективности ЖГВ из штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) на модели хорьков 143
6.4 Подготовка и доклиническое изучение живой гриппозной вакцины против высокопатогенного потенциально-пандемического вируса A(H7N9) 150
6.5 Клинические испытания живой гриппозной вакцины против потенциально-пандемического вируса A(H7N9) на добровольцах (I фаза) 157
6.5.1. Оценка реактогенности ЖГВ H7N9 на добровольцах 157
6.5.2. Оценка приживляемости, трансмиссивности и генетической стабильности ЖГВ H7N9 на добровольцах 158
6.5.3. Оценка иммуногенности ЖГВ H7N9 на добровольцах 159
Глава 7 Подготовка и доклиническое изучение живой гриппозной вакцины против потенциально пандемических вирусов гриппа A(H5N1) 167
7.1 Получение и фенотипическая характеристика вакцинных штаммов ЖГВ против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) 167
7.2 Изучение вакцинных штаммов ЖГВ против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели мышей 170
7.2.1. Оценка аттенуации вакцинных штаммов ЖГВ против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели мышей 170
7.2.2. Оценка иммуногенности вакцинных штаммов ЖГВ против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели мышей 171
7.2.3. Оценка защитной эффективности вакцинных штаммов ЖГВ против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели мышей 174
7.3 Сравнительное изучение живой и инактивированной гриппозных вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели хорьков 176
7.3.1. Оценка безвредности живой гриппозной вакцины против высокопатогенного вируса гриппа A(H5N1) на модели хорьков 176
7.3.2. Оценка иммуногенности живой и инактивированной гриппозных вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели хорьков 177
7.3.3. Оценка защитной эффективности живой и инактивированной гриппозных вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа A(H5N1) на модели хорьков 179
7.4 Изучение патогенности живой гриппозной вакцины против высокопатогенного вируса гриппа A(H5N1) на курах 181
7.4.1. Оценка патогенности вакцинного штамма VN-Лен/17rg (H5N1) для кур при внутривенном введении 182
7.4.2. Оценка репликации вакцинного штамма VN-Лен/17rg (H5N1) в органах кур при интраназальном введении 182
Глава 8 Разработка живой гриппозной вакцины, индуцирующей широкий спектр перекрестно-реагирующих факторов иммунного ответа 185
8.1 Подходы к индукции кросс-реактивного гуморального иммунного ответа 185
8.1.1. Конструирование живых гриппозных вакцин, экспрессирующих химерные молекулы гемагглютинина, и оценка их биологических свойств 185
8.1.2. Оценка иммуногенности и защитной эффективности живых гриппозных вакцин, экспрессирующих химерные молекулы гемагглютинина, на модели мышей линии C57BL/6J 189
8.1.3. Оценка иммуногенности и защитной эффективности живых гриппозных вакцин, экспрессирующих химерные молекулы гемагглютинина, на модели мышей линии BALB/c 195
8.2 Подходы к индукции перекрестно-реагирующего Т-клеточного иммунитета 200
8.2.1. Анализ консервации CD8+ Т-клеточных эпитопов в нуклеопротеине донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и современных циркулирующих вирусов H1N1 и H3N2. 200
8.2.2. Сравнительная оценка ростовых характеристик вакцинных штаммов ЖГВ с формулами генома 6:2 и 5:3 in vitro. 203
8.2.3. Сравнительная оценка иммуногенности для мышей реассортантных штаммов ЖГВ H1N1pdm09 и H7N9 с формулами генома 6:2 и 5:3. 205
8.2.4. Сравнительная оценка безвредности, иммуногенности и защитной эффективности реассортантных штаммов ЖГВ H3N2 с формулами генома 6:2 и 5:3 на модели хорьков. 214
8.2.5. Оценка кросс-реактивности Т-клеток человека к различным эпитопам нуклеопротеина in vitro 223
Обсуждение результатов 230
Заключение 252
Выводы 255
Список сокращений 257
Список литературы 263
