Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика вируса ИЛТ .13
1.1.1. Классификация .13
1.1.2. Состав и морфология .13
1.1.3. Устойчивость к физико-химическим факторам 14
1.1.4. Структура генома .15
1.1.5. Репликация вируса .17
1.1.6. Биологические свойства вируса .28
1.1.7. Вакцинопрофилактика 29
1.1.8. Молекулярная эпидемиология 36
1.1.8.1. Диагностика и дифференциация 36
1.1.8.2. Полногеномное секвенирование .41
1.2. Заключение по обзору литературы 45
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Вирусы ИЛТ птиц .46
2.1.2. Нуклеотидные последовательности полных геномов изолятов и штаммов вируса ИЛТ опубликованные в базе данных GenBank .46
2.1.3. Наборы реактивов 47
2.1.4. Растворы, буферные смеси, реактивы и ферменты 48
2.1.5. Праймеры 49
2.1.6. Оборудование .51
2.1.7. Куриные эмбрионы 51
2.1.8. Естественно восприимчивые животные .52
2.2. Методы 52
2.2.1. Дизайн праймеров для ПЦР 52
2.2.2. Выделение суммарной нуклеиновой кислоты 52
2.2.3. ПЦР в режиме реального времени .52
2.2.4. Классическая ПЦР .54
2.2.5. Очистка продуктов ПЦР .57
2.2.6. Секвенирование амплифицированных фрагментов .57
2.2.7. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ 59
2.2.8. Секвенирование последовательности генома .60
2.2.9. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот 61
2.2.10. Выделение и культивирование вируса ИЛТ .61
2.2.11. Определение титра инфекционной активности вируса .62
2.2.12. Экспериментальное заражение естественно восприимчивых животных .63
2.2.13. Серологические исследования 64
2.2.14. Статистическая обработка результатов .64
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 65
3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей областей генома изолятов и штаммов вируса ИЛТ, представленных в GenBank 66
3.1.1. Анализ области гена ICP4 и полученных нуклеотидных последовательностей участка гена тимидинкиназы (ТК) и участка нетранслируемой области гена ICP4 (UTRICP4) штаммов и изолятов вируса ИЛТ, циркулирующих на территории РФ и представленных в GenBank .67
3.2. Определение и анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643, Rus/Ck/Penza/2013/2701 и вакцинного штамма «О» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») вируса ИЛТ 73
3.2.1. Сравнительный анализ полученных последовательностей полных геномов и представленных в GenBank .74
3.2.2. Обнаружение и анализ наиболее вариабельного участка в полученных последовательностях полных геномов изолятов и штаммов вируса ИЛТ 80
3.2.3. Разработка метода идентификации сайта инициации репликации генома вируса ИЛТ с помощью ПЦР .84
3.2.4. Разработка метода дифференциации полевых изолятов и штаммов вируса ИЛТ с использованием ПЦР и нуклеотидного секвенирования 87
3.3. Изучение вирулентных свойств выделенных изолятов Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643 и Rus/Ck/Penza/2013/2701 вируса ИЛТ, при экспериментальном заражении цыплят 4-недельного возраста 103
4. Заключение .115
4.1. Выводы 121
5. Практические предложения .122
6. Список использованной литературы .123
7. Приложения 141
