Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1. Понятия о нейротрофических факторах 15
1.1. Классификация нейротрофических факторов 16
1.2. Сравнительная характеристика представителей семейства GDNF лигандов. 17
1.2.1.Артемин (ARTN) 17
1.2.2. Нейртурин (NRTN) 18
1.2.3. Персефин (PSPN) 18
1.2.4. Глия-производный нейротрофический фактор (GDNF) 19
2. Рецепторы нейротрофических факторов. 25
2.1. Рецепторы семейства GDNF 25
2.2. Характеристика GFR рецепторов 28
2.2.1. Особенности структуры GFRs рецепторов семейства GDNF (GFRs) 29
2.3. Характеристика рецептора тирозинкиназы. 31
2.3.1. Особенности структуры RET 33
2.4. Образование GDNF-GFR-RET комплекса 35
3. Влияние GDNF на нейральные клетки 37
4. Возможные способы применения GDNF в клинике. 39
5. Hsp70 промотор, как регулируемая система активации гена 42
5.1. Фактор теплового шока (HSF) 44
5.1.1. Понятие о факторе теплового шока (HSF) 44
5.1.2. Классификация факторов теплового шока (HSF) 45
5.2. Основные характеристики промотора hsp70 48
5.2.1. Этапы регуляции промотора hsp70 48
5.2.2. Особенности строения промотора hsp70 50
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1. Объекты 54
2.1.1. Белки, ферменты и реактивы 54
2.2. Общие методы работы с бактериями Escherichia coli. 54
2.2.1.Получение компетентных клеток 54
2.2.2.Трансформация компетентных клеток плазмидами 55
2.3 Методы работы с ДНК 55
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. сoli в малом объеме (Miniprep) 55
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК в большом объеме (Maxiprep) 56
2.3.3.Электрофорез в агарозном геле 57
2.4. Методы генетической инженерии 57
3.4.1.Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 57
2.4.2.Рестрикция плазмидной ДНК 58
2.4.3. Выделение фрагментов ДНК из геля 58
2.4.4. Лигирование 59
2.4.5. Анализ ДНК-последовательности 59
2.4.6. Схема клонирования продукта амплификации в pGEM - T Easy вектор. 59
2.4.7. Очистка плазмид для введения в культуру клеток млекопитающих. 60
2.5. Работа с культурой клеток НЕК293 60
2.5.1 Ведение культуры клеток НЕК293 60
2.5.2. Введение плазмиды в клетки линии НЕК293 методом трпнсфекции 61
2.5.3.Анализ промотора hsp70 Drosophila melanogaster с регуляторной последовательностью 61
2.5.4. Получение трансгенных клеточных культур. 62
2.6. Определение уровня экспрессии репортерных генов 62
2.6.1. Выделение тотальной РНК из культуры клеток НЕК 293. 62
2.6.2. Получение кДНК к GDNF (Обратная транскрипция). 63
2.6.3. Обратная транскрипция. 63
2.6.4. Выделение белка из клеток для Вестерн-блот гибридизации. 64
2.6.5. Выделение белка из кондиционированной среды культур клеток. 64
2.6.6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. 64
2.6.7. Вестерн-блот гибридизация. 65
2.7. Модели для анализа нейропротекторной способности изоформ GDNF 66
2.7.1. Получение кондиционированных сред с трансгенных клеточных линий. 66
2.7.2. Получение кондиционных сред после культивации трансгенных клеток. 66
2.7.3. Культивация клеток РС12 и анализ образования отростков 67
2.7.4.Методика получения спинальных ганглиев. 68
2.7.5. Оценка апоптоза. 68
2.7.6. Количественная оценки методом ELISA. 69
2.8. Иммуногистохимический анализ. 69
2.8.1.Иммуноцитохимический анализ спинальных ганглиев. 69
2.8.2. Проведение трансплантации. 70
2.8.3. Иммуногистохимический анализ зоны трансплантации. 70
Глава 3. Результаты 73
3.1. Анализ экспрессии и секреции GDNF в зависимости от наличия pre- и pro областей 73
3.2. Изучение фактора GDNF под контролем регулируемого промотора hsp70 Drosophila melanogaster 101
Обсуждение 116
Заключение 122
Выводы 123
Список литературы 124
