Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Применение самособирающихся структур на основе нуклеиновых кислот 8
1.1.1. Аптамеры 10
1.1.2. Структуры и материалы 12
1.1.3. Подвижные молекулы 15
1.1.4. Элементы компьютеров 16
1.1.5. Ферменты 18
1.1.6. Молекулярные автоматы 20
1.1.7. «Умные» лекарства 20
1.2. Методы выделения клеточных популяций 23
1.2.1. Механические и гидродинамические методы разделения клеток 23
1.2.2. Электрофоретические методы разделения клеток 25
1.2.3. Микрофлюидные устройства 26
1.2.4. Оптофорез 27
1.2.5. Проточная цитофлуорометрия 28
1.2.6. Магнитная сепарация 30
2. Материалы и методы 33
2.1. Выделение лейкоцитарной фракции клеток крови 33
2.2. Олигонуклеотиды и конъюгация олигонуклеотидов с антителами
2.2.1. Методика получения конъюгатов олигонуклеотид-антитело (на примере получения конъюгата Ритуксан-олигонуклеотид) 34
2.2.2. Определение концентрации олигонуклеотидов 36
2.3. Очистка конъюгатов олигонуклеотид-антитело с помощью гель фильтрации 37
2.4. Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 37
2.5. Последовательности олигонуклеотидов 38
2.6. Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности 41
2.7. Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности в цельной крови 42
2.8. Методика выделения клеточных популяций с помощью «молекулярных автоматов» на примере CD3 Т-лимфоцитов 42
2.9. Проточная цитофлуорометрия и статистический анализ 43
2.10. Иммунофенотипическое окрашивание 44
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Конструирование «молекулярного автомата» 46
3.1.1. Введение 46
3.1.2. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов 48
3.1.3. Апробирование работы молекулярного автомата в растворе 50
3.1.4. Оптимизация нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов, использованных для конструирования молекулярных автоматов 51
3.2. Создание молекулярного автомата для одновременного определения наличия двух маркеров на клеточной поверхности 55
3.2.1. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности 55
3.2.2. Разработка методики прямого конъюгирования антител с олигонуклеотидами 58
3.2.3. Экспериментальная модель, использованная для изучения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов 59
3.2.4. Функциональное тестирование работы конъюгатов антитело олигонуклеотид 60
3.2.5. Апробация молекулярных автоматов с использованием конъюгатов олигонуклеотид-антитело 62
3.2.6. Апробация использования молекулярного автомата с целью определения отдельной лимфоцитарной субпопуляции 65
3.2.7. Каскады последовательного замещения олигонуклеотидов протекают только при условии наличия на клеточной поверхности всех определяемых маркеров 66
3.2.8. Избыток конъюгатов олигонуклеотид-антитело, находящихся в растворе, не влияет на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов 75
3.2.9. Прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов не зависит от определенного олигонуклеотида и определенного антитела, составляющих конъюгат
3.3. Создание молекулярного автомата для определения редких популяций клеток 82
3.4. Создание молекулярного автомата для одновременного определения трех маркеров 86
3.5. Апробация работы молекулярного автомата в цельной крови 91
3.6. Использование молекулярных автоматов для выделения индивидуальных клеточных популяций 93
3.6.1. Выделение CD3 Т-лимфоцитов с помощью молекулярного автомата
3.6.2. Выделение наивных CD3 Т-лимфоцитов с помощью молекулярных автоматов 97
3.6.3. Выделение наивных CD4 Т-лимфоцитов с помощью молекулярных автоматов 99
Заключение 101
Выводы 103
Список литературы
