Введение
Обзор литературы 12
1 Структура и функции теломер 12
1.1 Структура теломерной ДНК у разных организмов .12
1.1.1 Типичная структура теломерной ДНК 12
1.1.2 Нетипичная структура теломерной ДНК 15
1.2 Шелтерин .17
1.3 Функции теломер 18
2 Длина теломерной ДНК и ее изменение 19
2.1 Концевая недорепликация ДНК 19
2.2. Механизмы регуляции длины теломер 20
2.2.1 Теломераза и ее роль в регуляции длины теломер . 20
2.2.2 Поддержание длины теломер с помощью ретротранспозонов 26
2.2.3 Роль гомологичной рекомбинации в регуляции длины теломер.27
2.2.4 Тримминг 28
2.3 Длина теломерной ДНК у разных организмов и возможные причины ее вариабельности .30
2.4 Динамика теломерной ДНК .36
3 Биология теломер и пол .38
4 Биология теломер в свете экологии .40
5 Биология теломер плоских червей и моллюсков 44
6 Байкальские планарии и моллюски .47
Материалы и методы 49
1 Объекты исследования 49
1.1 Байкальские планарии .49
1.2 Байкальские моллюски 51
2 Методы исследования 53
2.1 Морфологический анализ 53
2.2 Методы молекулярной и клеточной биологии 54
2.2.1 Выделение тотальной ДНК 54
2.2.1.1 Выделение тотальной ДНК из планарий 54
2.2.1.2 Выделение тотальной ДНК из моллюсков 55
2.2.2 Определение нуклеотидной последовательности теломерной ДНК у планарий 55
2.2.3 Определение типа теломерного повтора посредством ПЦР с одним праймером 56
2.2.4 Определение длины теломерной ДНК с помощью метода TRF (Terminal Restriction Fragments) 57
2.2.4.1 Получение теломерных проб с помощью безматричной ПЦР .57
2.2.4.2 Радиоактивное мечение теломерных проб 57
2.2.4.3 Нерадиоактивное мечение теломерных проб .58
2.2.4.4 Рестрикция ДНК 59
2.2.4.5 TRF анализ 60
2.2.5 Dot гибридизация .60
2.2.6 Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 61
2.2.6.1 Получение препаратов для FISH .61
2.2.6.2 FISH 61
2.2.7 ПЦР на фрагмент гена актина 62
2.2.7.1 Конструирование праймеров на фрагмент гена актина моллюсков и планарий 62
2.2.7.2 ПЦР и секвенирование фрагмента гена актина планарий 63
2.2.7.3 ПЦР и секвенирование фрагмента гена актина моллюсков 64
2.2.8 ПЦР в реальном времени 64
2.2.8.1 ПЦР в реальном времени с ДНК планарий 65
2.2.8.2 ПЦР в реальном времени с ДНК моллюсков 66
2.2.9 Определение активности теломеразы 67
2.2.9.1 Выделение экстракта, содержащего РНК и белки 67
2.2.9.2 TRAP (Telomeric repeat amplification protocol) и окраска продуктов нитратом серебра 68
2.2.10 Филогенетический анализ 70
2.2.10.1 ПЦР на фрагменты генов рибосомальной РНК 70
2.2.10.2 Филогенетическая реконструкция на основе генов рРНК и актина планарий 71
2.3 Статистический анализ 72
Результаты 73
1 Теломерный повтор у байкальских планарий. 73
2 Теломерные повторы в тотальной ДНК планарий и моллюсков 74
3 Локализация теломерных повторов TTAGGG в хромосомах моллюсков и планарий 77
4 Вариабельность количества теломерной ДНК у ювенильных особей планарий и эмбрионов моллюсков 79
5 Длина теломерной ДНК и возрастные изменения ее количества у моллюсков .80
6 Длина теломерной ДНК и возрастные изменения ее количества у планарий 86
6.1 Активность теломеразы у моллюсков 92
6.2 Активность теломеразы у планарий 93
7 Длина теломерной ДНК и филогения байкальских планарий. 94
Обсуждение .97
1 Структура теломерного повтора .97
2 Локализация теломерных повторов в хромосомах 98
3 Длина теломерной ДНК и ее связь с филогенией 99
4 Динамика теломерной ДНК и активность теломеразы у планарий .102
5 Динамика теломерной ДНК и активность теломеразы у моллюсков 105
Заключение 110
Выводы 112
Список сокращений 113
Список литературы 114
