Введение
1. Обзор литературы .13
1.1. Общие сведения о гене сестрине 13
1.2. Сигнальные пути сестринов .14
1.3. Молекулярные механизмы старения .19
1.4. Роль TOR в старении 22
1.5. Нематода C.elegans как модельный организм 24
2. Материалы и методы 29
2.1. Штаммы, использованные в исследовании 29
2.2. Реактивы, наборы реактивов 31
2.3. Культурирование нематод на чашках Петри 33
2.4. Приготовление синхронизированной культуры нематод .34
2.5. Выделение тотальной РНК из нематод 34
2.6. Обработка РНК, выделенной из нематод, дезоксирибонуклеазой I 36
2.7. Обратная транскрипция .36
2.8. Амплификация кДНК генов нематоды при помощи ПЦР .37
2.9. РНК-интерферирующие генетические конструкции .38
2.10. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК .41
2.11.Генетическая конструкция для восстановления генотипа дикого типа сестрина нематоды 41
2.12. РНК-интерференция с помощью бактерий 42
2.13. ПЦР в режиме реального времени .42
2.14. Измерение продолжительности жизни при РНК интерференции гена cSESN, при отсутствии пищи .44
2.15. Исследование аутофагии с помощью флуоресцентного микроскопа 45
2.16. Измерение продолжительности жизни в среде М9 45
2.17. Измерение продолжительности жизни при воздействии параквата и перекиси водорода .45
2.18. Исследование образования дауэровских личинок с помощью лаурилсульфата натрия .46
2.19. Денатурирующий ПААГ элегтрофорез .46
2.20. Иммуноблоттинг 49
2.21. Исследование глоточной области нематод с помощью электронного микроскопа 49
2.22. Исследование мышечной дегенерации с помощью флуоресцентного микроскопа 51
2.23. Измерение продолжительности жизни под действием различных концентраций торина 2 и рапамицина .51
2.24. Измерение продолжительности жизни нематод разных возрастов под действием торина 2 в концентрации 25нМоль/мл 51
2.25. Исследование воздействия на онтогенез торина 2 и рапамицина 52
2.26. Трансформирование нематод с помощью микроиньекций в яичники .52
2.27. Скрещивание штаммов нематод .52
2.28. Исследование сигнальных путей образования дауэровских личинок .54
2.29. Статистическая обработка данных 54
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Влияние сестрина на размеры нематоды 55
3.2. Роль гена сестрина в устойчивости нематоды к различным стрессам 56
3.3. Роль гена сестрина в образовании устойчивых к стрессам дауэровских личинок 59
3.4. Роль гена сестрина в гомеостазе мышц 61
3.5. Влияние сестрина на продолжительность жизни нематоды .63
3.6. Роль гена сестрина в регуляции аутофагии 64
3.7. Воздействие торина 2 и рапамицина на продолжительность жизни нематоды 68
3.8. Воздействие торина 2 и рапамицина на аутофагию .68
3.9. Воздействие торина 2 на продолжительность жизни нематод разных возрастов 72
3.10. Воздействие торина 2 и рапамицина на онтогенез .77
Заключение .81
Выводы 82
Благодарности .83
Список литературы 84
Приложение .103
