Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Инициация трансляции эукариот 13
1.1.1. Активация мРНК 13
1.1.2. Сборка 43S инициаторного комплекса 14
1.1.3. Загрузка мРНК, сканирование 5 НТО и выбор старт-кодона 17
1.1.4. Образование 80S 20
1.2. Элонгация трансляции эукариот 20
1.3. Терминация трансляции 25
1.3.1. Факторы терминации трансляции 25
1.3.2. Взаимодействие eRF1-eRF3 28
1.3.3. Факторы терминации трансляции в рибосоме 29
1.4. Рециклинг рибосом 35
1.5. Closed-loop мРНК 36
1.5.1 Closed loop. Протеолитическое расщепление факторов 38
1.6. РАВР 39
1.6.1. Структура 39
1.6.2. Изоформы и функции 41
1.7. PAIP1 43
1.7.1. Структура PAIP1 44
1.7.2. Изоформы и функции PAIP1 45
1.8. PAIP2 46
1.9. eIF4G 47
1.9.1. Структура eIF4G 47
1.9.2. Функции eIF4G 50
1.10. Заключение 52
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 53
2.2. Используемые среды 56
2.3. Используемые буферы и реактивы 56
2.4. Используемые антитела 58
2.5. Используемые ферменты 59
2.6. Используемые праймеры 59
2.7. Общие молекуляно-биологические методы, используемые в работе 60
2.7.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.7.2. Электрофорез в агарозном геле 60
2.7.3. Очистка фрагментов ДНК из агарозы 60
2.7.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 61
2.7.5. Лигирование ДНК 61
2.7.6. Переосаждение ДНК 61
2.7.7. Трансформация E. coli плазмидной ДНК 61
2.7.8. Анализ клонов методом ПЦР-скрининга 62
2.7.9. Выделение плазмидной ДНК из E. coli 62
2.7.10. Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК при помощи автоматической системы Applied Biosystems ABI 310. 62
2.7.11. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ 62
2.7.12. Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем ПААГ 63
2.7.13. Иммуноблотинг 63
2.8. Выделение и очистка белков 63
2.8.1.Выделение компонентов для реконструированной системы трансляции 63
2.8.2. Экспрессия и выделение PABP 64
2.8.3. Выделение и очистка GST химер PAIP1, PAIP2, p100, p50,. МА3, eIF4G2 64
2.8.4. Выделение и очистка PAIP1, PAIP2, p100, МА3, W2, p50, eIF4G2, p86 64
2.8.5. Экспрессия и выделение eRF3a 65
2.9. Получение мРНК для реконструированной системы in vitro 66
2.10. Сборка преТК 67
2.11. Тоу-принт анализ 67
2.12. Анализ гидролиза пептидил-тРНК 67
2.13. GTPазный тест 68
2.14. Pull down анализ 68
2.15. Cвязывание факторов с ТК 68
2.16.Связывание факторов с рибосомами 69
2.17. Гель-фильтрация белковых комплексов 69
2.18. Получение кэпированных мРНК для люциферазного теста в бесклеточной системе трансляции 69
2.19. Люциферазный тест в бесклеточной системе трансляции 70
2.20. Статистическая обработка данных 70
Глава 3. Результаты и их обсуждение 71
3.1. PABP стимулирует эукариотическую терминацию трансляции 71
3.1.1. РАВР стимулирует узнавание стоп кодона 71
3.1.2. PABP стимулирует образование ТК в присутствии негидролизуемого аналога GTP -GDPCP 73
3.1.3. PABP связанный с поли(А) хвостом стимулирует образование ТК 74
3.1.4. РАВР стимулирует гидролиз пептидил-тРНК 76
3.1.5. РАВР не влияет на GTPазную активность eRF3 78
3.1.6. C – концевая часть РАВР необходима и достаточна для стимуляции терминации трансляции 79
3.1.7. РАВР стимулирует загрузку комплекса eRF1eRF3a в вакантную 80S рибосому 80
3.1.8. PABP диссоциирует от eRF3а после загрузки в рибосому 83
3.1.9. Разработка методов связывания белков с преТК 84
3.1.10. PABP стимулирует загрузку комплекса eRF1eRF3a в преТК 84
3.1.11. Модель механизма действия РАВР на терминацию трансляции 86
3.2. Эффекты PAIP1 и PAIP2 на терминацию трансляции эукариот 87
3.2.1 Количественная оценка результатов toe-print анализа 87
3.2.2. PAIP1 влияет на формирование терминационного комплекса 88
3.2.3. PAIP1 не влияет на узнавание стоп кодона в присутствии GDPCP 89
3.2.4. PAIP1 взаимодействует с eRF3 90
3.2.5. PAIP1 и PAIP2 подавляют стимулирующий эффект PABP на формирование ТК 92
3.2.6. PAIP2 отменяет эффект PAВР на гидролиз-пептидил-тРНК 94
3.2.7. PAIP1 и PAIP2 стимулируют сквозное чтение стоп кодонов 95
3.2.8. Модель действия PAIP1 и PAIP2 в терминации трансляции 98
3.3. eIF4F стимулирует терминацию трансляции эукариот 99
3.3.1. Гидролиз пептидил-тРНК стимулируется разными формами eIF4G 100
3.3.2. GTPазная активность eRF3 активируется MIF4G доменом. 103
3.3.3. Обе изоформы eIF4G стимулируют образование ТК 107
3.3.4. eIF4G связывается с обоими факторами терминации трансляции различными доменами 110
3.3.5. eIF4G не стимулирует загрузку факторов терминации в рибосому 114
3.3.6. Эффекты других белков на активность eIF4G в терминации трансляции 115
3.3.7. Модель стимуриующего эффекта eIF4G в терминации трансляции эукариот 118
3.4. Инициаторная метиониновая тРНК стимулирует формирование ТК 119
3.5. Эффекты факторов формирующих closed loop на терминацию трансляции 120
Глава 4. Заключение 122
Выводы 123
Список использованной литературы 124
