Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика рицина 11
1.1.1. Рибосом-инактивирующие лектины 11
1.1.2. Строение рицина и его действие на эукариотические клетки 13
1.1.3. Биосинтез рицина 19
1.1.4. Транспорт рицина в клетках млекопитающих 20
1.1.5. Действие А-субъединицы рицина на рибосомы 24
1.1.6. Иммунологические свойства рицина 27
1.2. Профилактика излечение отравлений рицином 30
1.2.1. Воздействие рицина на организм животных 30
1.2.2. Разработка антидотов против рицина 33
1.2.3. Разработка вакцин против отравлений рицином 35
1.2.4. Разработка тест-систем для обнаружения рицина 41
1.3. Применение субъединиц рицина в медицине 44
1.3.1. Иммунотоксины 44
1.3.2. Адъюванты для создания вакцин 47
1.4. Использование технологии создания химерных белков для получения рекомбинантных антигенов 48
1.4.1. Аффинные домены и белки-носители 50
1.4.2. Применение целлюлозы, как иммуносорбента 63
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 67
2.1. Материалы и реактивы 67
2.1.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды 67
2.1.2. Бактериальные штаммы и среды 67
2.1.3. Ферменты 67
2.1.4. Сорбенты 67
2.1.5. Другие реактивы 68
2.1.6. Буферные растворы . 68
2.1.7. Лабораторные животные 70
2.1.8. Оборудование .. л. 70
2.2. Основные методики 71
2.2.1. Выделение ДНК клещевины 7Г
2.2.2. Полимеразная цепная реакция 72
2.2.3. Химико-ферментативный синтез 72
2.2.4. Сайт-специфический мутагенез 72
2.2.5. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами 73
2.2.6. Фракционирование.фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 73
2.2.7. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля 73
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК 73
2.2.9. Выделение и очистка аналитического количества плазмидной ДНК 74
2.2.10. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК 75
2.2.11. Определение нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК....76 . 2.2.12. Подготовка компетентных клеток Е. coli для трансформации плазмидной ДНК электропорацией 76
2.2.13. Трансформация клетокЕ. coli 76
2.2.14. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН 77
2.2.15. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков 77
2.2.16. Определение растворимости белков 78
2.2.17. Определение периплазматической локализации белков 79
2.2.18. Выделение и очистка белков, содержащих НІ8б-аффинную метку 79
2.2.19. Выделение и очистка белков, содержащих CBD 81
2.2.20. Иммунизация кроликов 82
2.2.21. Непрямой ИФА 82
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 83
3.1. Получение рекомбинантных аутентичных RTA и RTB 83
3.1.1. Ююнирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTA 87
3.1.2. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTB 89
3.1.3. Экспрессия рекомбинантных генов аутентичных RTA и RTB в клетках Е. coli М15 93
3.2. Получение рекомбинантной мутантной RTA 95
3.2.1. Клонирование нуклеотиднойпоследовательности мутантной RTA 96
3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена мутантной RTA в клетках Е. coli Ml5 98
3.3. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме Е. соН99
3.3.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD 101
3.3.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в клетках Е. coli М15 105
3.4. Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств 105
3.4.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR 106
3.4.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR в клетках Е. coli М15 108,
3.4.3. Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR 110
3.4.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR 111
3.5. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в периплазме Е. coli и исследование их иммуногенных и антигенных свойств 113
3.5.1. Клонирование гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD 115
3.5.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD вЕ. соНМ15 117
3.5.3. Выделение и очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD 119
3.5.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD 121
ВЫВОДЫ 125
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
