Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Клиническая значимость разработок в области терапевтического ангиогенеза и актуальность задач 11
1.2 Механизмы васкуляризации в постнатальном периоде
1.2.1 Ангиогенез: механизмы и роль факторов, индуцируемых гипоксией (HIF) в его активации 13
1.2.2 Артериогенез и его механизмы: влияние напряжения сдвига и участие клеток воспаления 18
1.2.3 Васкулогенез в постнатальном периоде 21
1.2.4. Роль АФР как ключевых регуляторов ангиогенеза, артериогенеза и васкулогенеза.. 22
1.3 Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и их роль в ангиогенезе 22
1.3.1 VEGF: краткая характеристика семейства факторов роста 22
1.3.2 Рецепторы VEGF и механизмы влияния VEGF нарост сосудов 23
1.3.3 Функциональная характеристика изоформ VEGF-A и их участие в ангиогенезе 24
1.4 Фактор роста гепатоцитов как плеотропный АФР и его биологическая активность25
1.4.1 Структура и механизмы активации HGF 25
1.4.2 Рецептор c-met и его тирозинкиназная активность 26
1.4.3 Роль PGF в развитии и его участие в постнатальной васкуляризации и регенерации. 1.5 Взаимодействие между VEGF165 и HGF в регуляции ангиогенеза 28
1.6 Клиническая и прогностическая значимость уровня VEGF165 и HGF при ишемических заболеваниях
1.6.1 Клиническая и прогностическая значимость VEGF165 в патогенезе ишемических заболеваний 30
1.6.2 Изменения содержания HGF при сердечно-сосудистых заболеваниях 31
1.7 Терапевтический ангиогенез: развитие направления и генная терапия 33
1.7.1 Клинические исследования генной терапии VEGF165 приКИНК и ИМ 33
1.7.2 Клинические исследования генной терапии HGF приКИНК 36
1.7.3 Клинические исследования генной терапии с помощью FGF 37
1.8 Факторы, определяющие эффективность генной терапии и возможности
усовершенствования существующих методов 38
1.8.1 Выбор вектора для генной терапии: баланс эффективности и безопасности 38
1.8.2 Выбор способа доставки вектора в ишемизированную ткань з
1.8.3 Дозировка и продолжительность лечения 42
1.8.4 Использование комбинированной генной терапии для стимуляции ангиогенеза 43
1.9 Заключение 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Группа больных ИБС с постинфарктной ХСН и контрольная группа здоровых добровольцев 47
2.2 Молекулярные и биохимические методы 48
2.3 Цитологические методы 53
2.4 Эксперименты на животных 56
2.5 Гистологические методы и опыты ex vivo 58
2.6 Микроскопические методики 60
2.7 Статистическая обработка данных 61
Глава 3. Результаты 62
3.1 Исследование содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови и определение их
значимости как биомаркеров тяжести течения и развития постинфарктной ХСН 62
3.1.2 Оценка содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови больных ИБС 65
3.1.3 Корреляционный анализ содержания VEGF165 и HGF и уровня маркеров тяжести ХСН в сыворотке крови больных ИБС 66
3.1.4 Регрессионный анализ показателей содержания VEGF165 и HGF и выявление пороговых значений, ассоциированных с ИБС 67
3.2 Конструирование и оценка экспрессионной активности плазмид с генами
человеческих VEGF165 и HGF in vitro 71
3.2.1 Конструирование плазмид с генами VEGF165 и HGF и амплификация пДНК в бактериях Е. Coli 71
3.2.2 Определение содержания бактериального эндотоксина в плазмидной ДНК 71
3.2.3 Продукция VEGF165 и HGF трансфицированными клетками НЕК293Т 71
3.2.4 Оценка функциональных свойств секретируемых VEGF165 и HGF на культуре клеток HUVEC 73
3.3. Отработка плазмидной трансфекции in vivo и оценка продукции человеческих VEGF165 и HGF в ткани экспериментальных животных 75
3.3.1 Оценка эффективности трансфекции скелетной мышцы мыши in vivo при использовании чрескожной электропорации 75
3.3.2 Оценка продукции VEGF165 и HGF человека в скелетной мышце мыши и миокарде крысы с помощью эксплантной культуры 76
3.3.3 Определение содержания VEGF и HGF человека в гомогенатах скелетной мышцы мыши и миокарда крысы после введения плазмид 79
3.4 Оценка ангиогенной эффективности плазмид с генами VEGF165 и HGF на мышиной модели ишемии задней конечности 81
3.4.1 Динамика восстановления кровотока в ишемизированной задней конечности мыши после введения плазмид с генами VEGF165, HGF или их комбинации 81
3.4.2 Гистологический анализ образцов ишемизированных скелетных мышц после введения плазмид с генами VEGF 165, HGF или их комбинации 83
3.5 Оценка ангиогенных свойств плазмид с генами VEGF165 и HGF при введении в ишемизированный миокард крысы 86
3.5.1 Влияние введения плазмид с генами VEGF 165 и HGF на размер ИМ и площадь постинфарктного фиброза 86
3.5.2 Оценка плотности сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами VEGF 165, HGF или их комбинации 87
3.5.3 Гистологическая оценка моноцитарной инфильтрации периинфарктной зоны миокарда после введения плазмид с генами VEGF 165 и HGF 90
3.6 Изучение молекулярных механизмов действия комбинации VEGF165 и HGF на ангио- и артериогенез 92
3.6.1 Анализ активации МАР-киназных сигнальных молекул при стимуляции эндотелия VEGF 165, HGF или их комбинацией 92
3.6.2 Влияние VEGF165 и HGF на продукцию эндотелием МСР-1 и интерлейкина-8 93
3.6.3 Оценка активации транскрипции генов МСР-1 и IL-8 в культурах HUVEC и ТГМЕ после стимуляции VEGF 165 и HGF 95
3.6.4 Анализ активности регуляторного каскада NFKB методом иммуноблоттинга 96
3.6.5 Оценка активности транскрипционных факторов HIF и промотора гена IL-8 с помощью плазмид с генами люцифераз 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 103
Заключение 127
Выводы 129
Список сокращений и обозначений 130
Список литературы
