Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 8
1. Технологии изготовления ДНК-микрочипов 8
1.1. Синтез олигонуклеотидов in situ 10
1.2. Постсинтетическая иммобилизация олигонуклеотидов 13
1.2.1. Методы модификации стеклянных подлооюек 16
1.2.2. Методы иммобилизации на полимерных подложках 23
1.2.3. Методы иммобилизагцш на полисахаридах 25
1.2.4. Методы определения поверхностной плотности аминогрупп 29
2. Детекция сигнала в гибридизационном анализе 32
2.1. Прямые методы 32
2.2. Детекция радиоактивных меток 33
2.3. Детекция ферментных меток. 33
2.4. Флуоресцентная детекция 35
3. Активные методы проведения гибридизационного анализа 37
4. Заключение и постановка задачи 41
3. Материалы и методы 42
1. Материалы и оборудование 42
1.1. Реактивы 42
1.2. Подложки 42
1.3. Олигонуклеотиды 43
1.4. Оборудование и программное обеспечение 44
2. Очистка стеклянных подложек. 44
3. Модификация стеклянных подложек в растворе 45
4. Модификация стеклянных подложек в газовой фазе 45
5. Щелочной гидролиз поверхности ПММА 45
6. Модификация поверхности ПММА действием ГМДА в растворе 46
7. Модификация поверхности ПММА действием паров ГМДА 46
8. Модификация поверхности полимеров действием олигомеров АПТЭС. 46
9. Измерение краевого угла смачивания поверхности водой 46
10. Определение плотности аминогрупп на поверхности активированных стекол 47
11. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности стеклянных и полимерных подложек. 47
12. Гибридизация олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов на микрочипах 48
12.1. Гибридизация комплементарных зондам олигонуклеотидов 48
12.1. Гибридизация продуктов ПЦР 49
13. Детекция биотиновой метки с помощью пероксидазной цветной реакции 49
14. Детекция флуоресцентной метки 50
15. Исследование стабильности активированных подложек и ДНК-микрочипов при хранении 50
16. Детекция с использованием суперпарамагнитных частиц 51
16.1. «Классический» метод 51
76.1. «Активный» метод 51
17. Определение отношения сигнал/шум 52
18. Изготовление полимерных пленок на подложках 52|
19. Определение неспецифической адгезии 52
20. Изготовление подложек с декстрановым покрытием 53
21. Изготовление ДНК-микрочипов на подложках с декстрановым покрытием 53
4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Исследование ДНК-микрочипов на стеклянных подложках. 54
4.2. Изготовление ДНК-микрочипов на полимерных подложках. 66
4.3. Детекция с помощью магнитных частиц в гибридизационном анализе 75
4.4. Изготовление ДНК-микрочипов на подложках с декстрановым покрытием 84
Заключение 91
