Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1.Хитин и хитозан - перспективные полимеры биомедицинского назначения 12
1.1.1. Источники выделения, структура, основные физико-химические свойства хитина и хитозана 12
1.1.2. Хитозан: взаимосвязь «структура - свойства» 17
1.1.3. Химическая модификация хитозана и использование производных хитозана в биомедицинской области 19
1.1.4. Биобезопасность хитина и хитозана: токсичность, биосовместимость биодеградируемость 21
1.2. Нано и микроструктур на основе хитозана для биомедицинского применения 23
1.2.1. Методы получения наночастиц хитозана 24
1.2.2. Физико-химические параметры наночастиц на основе хитозана 31
1.2.3. Влияние физико-химических параметров наночастиц на их взаимодействие с биологическими системами 32
1.3. Наночастицы хитозана как полимерные системы доставки лекарств 36
1.3.1. Введение биологически активных веществ (БАВ) в наночастицы 36
1.3.2. Контролируемое высвобождение БАВ из частиц 37
1.3.3. Наносистемы на основе хитозана для доставки доксорубицина 40
1.3.4. Наносистемы на основе хитина, хитозана и его производных для доставки
белков и пептидов 44
Глава 2.Экспериментальная часть 52
2.1. Реагенты и растворители 52
2.2. Лабораторное оборудование 53
2.3. Подготовка коммерческого хитозана к работе 54
2.3.1. Очистка хитозана переосаждением 54
2.2.1. Определение степени дезацетилирования хитозана (СД) 54
2.2.2. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана 2.3. Кислотный гидролиз высокомолекулярного хитозана 55
2.4. Синтез ацилированных производных хитозана 2.4.1. Синтез гексаноил-хитозана 56
2.4.2. Карбоксиацилирование хитозана 56
2.5. Получение наночастиц на основе хитозана и его производных 57
2.5.1.Получение наночастиц хитозана и его производных методом ионотропного
гелеобразования 57
2.5.2. Получение наночастиц сукциноил-хитозана (С3=80 %) методом солевого
осаждения 57
2.5.3. Получение наночастиц, меченных флуоресцеином изотиоцианатом 58
2.5.4. Получение наночастиц, меченных коммерческими флуоресцентными красителями Lightning-Link Atto 488 и Link Atto 547 58 2.6. Введение БАВ в наночастицы 59
2.6.1. Теоретический расчет заряда белков и пептидов 59
2.6.2 Сорбция белков на наночастицы ГХ и СХ 59
2.6.3. Сорбция пептидов на наночастицы ГХ и СХ 59
2. 6.4. Введение доксорубицина в НЧГХ и НЧСХ путем сорбции 60
2.6.5. Включение ДОКС в процессе формирования частиц 60
2.7. Контролируемое высвобождение ДОКС из наночастиц СХ 61
2.8. Физико-химические методы исследования 61
Определение размеров наночастиц методом конфокальной микроскопии 63
Определение количества белка по методу Бредфорд 64
2.9. Исследование биологической активности наночастиц in vitro 65
2.9. 1. Анализ цитотоксичности 65
2.9.2. Флуоресцентное окрашивание и анализ клеток методом конфокальной микроскопии 65
2.9.3. Метод проточной цитометрии 66
2.9.4.0пределение эффективности поглощения препаратов ДОКС методом флуоресцентной спектрофотометрии 66
2.9.5. Разделение клеток крови в градиенте плотности 66
2.9.6. Гемолиз эритроцитов 67
2.9.7. Взаимодействие наночастиц с плазмой крови 67
2.10. Биологическая активность НЧСХ-ДОКС in vivo 67
2.11. Биораспределение систем доставки доксорубицина 68
2.12. Фиксация тканей и приготовление криосрезов 68
Результаты и их обсуждение 69
Глава III Получение и физико-химические свойства наночастиц на основе хитозана и его производных 69
3.1.Получение наночастиц хитозана методом ионотропного гелеобразования..69
3.2. Стабилизация наночастиц хитозана 71
3.2.1. Формирование наночастиц на основе ацилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования 72
3.2.2. Получение наночастиц из сукциноил-хитозана с различной степенью замещения 74
3.2.3. Физико-химические характеристики наночастиц 76
Определение размера наночастиц методом динамического светорассеяния 76
Определение размеров частиц методом атомно-силовой микроскопии 79
Определение размеров НЧ методом анализа траектории наночастиц (АТН)
Стабильность наночастиц 82
3.4.2. Взаимодействие наночастиц с кровью 83
3.4.2.1. Взаимодействие НЧ с белками плазмы крови 83
3.4.2.2. Гемолиз эритоцитов 86
3.4.2.3. Взаимодействие НЧСХ с лимфоцитами периферической крови 87
ГЛАВА IV. Взаимодействие наночастиц хитозана с белками и пептидами 88
4.1. Сорбция модельных белков на НЧГХ и НЧСХ 88
4.2. Сорбция модельных пептидов на НЧГХ и НЧСХ 92
4.3. Физико-химическая характеристика комплексов наночастиц хитозана с белками 96
4.3.1. Определение размера и дзета - потенциала комплексов белков с наночастицами методом ДСР 96
ГЛАВА V. Разработка системы доставки противоопухолевого препарата доксорубицина на основе наночастиц хитозана 97
5.1. Формирование комплексов наночастиц гексаноил и сукциноил хитозана с доксорубицином 98
5.2. Анализ противоопухолевой активности доксорубицина в составе наночастиц хитозана в условиях in vitro 100
5.2.1. Цитотоксическая активность доксорубицина в составе наночастиц сукциноилхитозана 100
5.2.2. Кинетика высвобождения ДОКС в условиях in vitro 101
5.2.3. Эффективность связывания НЧСХ-ДОКС с клетками различных опухолевых линий 103
5.2.4. Прохождение наночастиц сукциноилхитозана с доксорубицином в клетки и внутриклеточный трафик 103
5.3. Изучение противоопухолевой активности комплекса доксорубицина с хитозаном в модели in vivo на мышах с раком молочных желез 105
5.4. Биораспределение ДОКС и ЫЧСХ - ДОКС in vivo 106
Заключение 110
Выводы 113
Список работ, опубликованных по теме диссертации .114
Благодарности 118
Список литературы
