Введение
1 Аналитический обзор литературных данных 13
1.1 Гибридные Fc-белки с терапевтической активностью 13
1.2 Строение, получение и свойства ЭПО-Fc 20
1.3 Механизм связывания Fc-гибридов с FcRn-рецептором 26
1.4 Механизм FcRn-опосредованного рециклирования и трансцитоза IgG и
Fc-содержащих белков 32
1.5 Сайты взаимодействия молекул IgG с Clq компонентом системы комплемента и FcR-рецепторами 34
1.6 Регуляция IgG-FcRn взаимодействия и направленная Fc-инженерия 37
1.7 Методы идентификации гибридных белков ЭПО-Fc в современном допинг-контроле 40
1.7.1 Полиакриламидный гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата (SDS-PAGE) и лаурилсаркозината (SAR-PAGE) натрия
1.7.2 Полиакриламидный гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF-PAGE) 46
1.7.3 2D – электрофорез ЭПО-Fc 50
1.7.4 Связывание ЭПО-Fc белками А и G, иммобилизованными на магнитных частицах с последующим количественным определением Fc-гибрида в элюате методом ИФА 51
2 Материалы и методы 53
2.1 Основное/вспомогательное оборудование, материалы, реагенты для идентификации запрещенного эритропоэз-стимулирующего агента – ЭПО Fc методами IEF/SDS/SAR-PAGE 53
2.1.1 Средства измерений 53
2.1.2 Испытательные средства 54
2.1.3 Вспомогательное оборудование 54
2.1.4 Химические реактивы и материалы
2.1.4.1 Исследуемые соединения 56
2.1.4.2 Реактивы 56
2.1.4.3 Материалы
2.2 Приготовление растворов и буферов 59
2.3 Формирование полиакриламидного геля 66
2.4 Приготовление образцов контроля качества
2.4.1 Отрицательный контрольный образец сыворотки (бланк) 68
2.4.2 Положительный контрольный образец сыворотки 68
2.4.3 Положительный контроль – –, –рЭПО 69
2.4.4 Положительный контроль – Аранесп (Дарбепоэтин-альфа, NESP)
2.4.5 Положительный контроль – CERA (Mircera, метокси-полиэтиленгликольэпоэтин-бета) 71
2.4.6 Положительный контроль – ЭПО-Fc 72
2.5 Методы 73
2.5.1 Иммуноаффинная очистка ЭПО-Fc 73
2.5.2 Изоэлектрическое фокусирование EPO-Fc 74
2.5.3 SDS/SAR-PAGE электрофорез EPO-Fc 75
2.5.4 Двойной Вестерн блотинг и визуализация 75
2.5.5 Определение различий в электрофоретической подвижности ЭПО-Fc до и после обработки IdeS-протеазой по сравнению с белками сыворотки крови методом SDS–PAGE 77
2.5.6 Подбор оптимального фермента для гидролиза ЭПО-Fc 78
2.5.7 Идентификация ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови и подбор оптимальных условий гидролиза IdeS-протеазой 79
2.5.8 Триптическое расщепление ЭПО-Fc в растворе 80
2.5.9 Выделение Fc-части из раствора, содержащего продукты гидролиза ЭПО-Fc IdeS-протеазой 81
2.5.10 Сверхэффективная жидкостная хроматография – тандемная
масс-спектрометрия высокого разрешения Fc-части молекулы ЭПО-Fc
3 Результаты и обсуждение 82
3.1 Выбор фермента для гидролиза ЭПО-Fc 84
3.2 Анализ возможных причин неудовлетворительного изоэлектрического разделения ЭПО-Fc 89
3.3 Характеризация электрофоретических профилей ЭПО-Fc после IdeS-гидролиза методами IEF/SDS/SAR-PAGE 98
3.4 Определение оптимальных условий гидролиза ЭПО-Fc 107
3.5 Методика идентификации ЭПО-Fc методом IEF-PAGE с последующим двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией сигнала (полный текст)
3.5.1 Пробоподготовка образцов сыворотки крови 109
3.5.2 Гидролиз в присутствии IdeS протеазы 111
3.5.3 Формирование полиакриламидного геля с градиентом рН 2–6 112
3.5.4 Проведение испытания 112
3.5.5 Интерпретация и представление данных 117
3.6 Валидация основных метрологических характеристик качественного определения ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови 118
3.6.1 Специфичность определения 118
3.5.1 Предел обнаружения 122
3.5.2 Влияние матрицы на изоэлектрическое разделение ЭПО-Fc 123
3.5.3 Степень извлечения 124
3.5.4 Стабильность при хранении образцов 127
Выводы 128
Список использованных источников 130
