Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Эмбриональные стволовые клетки 11
1.1.1. Получение ЭСК 11
1.1.2. Поддержание чЭСК 12
1.1.3. Дифференцировка ЭСК 13
1.1.4. Поверхностные антигены плюрипотентных клеток 14
1.1.5. Генетический контроль плюрипотентности 15
1.1.6. Эпигенетическая регуляция плюрипотентности 16
1.1.7. МикроРНК и плюрипотентность 17
1.1.8. Сигнальные пути, регулирующие плюрипотентность 18
1.1.9. Проблемы при культивировании ЭСК in vitro 19
1.1.10. Индукция плюрипотентности 20
1.2. Стволовые клетки (СК) взрослого организма 22
1.2.1. Маркеры стволовых клеток взрослого организма 23
1.2.2. СК костного мозга 25
1.2.3. Альтернативные источники МСК 26
1.2.4. МСК эндометрия 26
1.2.5. Сигнальные пути, регулирующие пролиферацию и дифференцировку СК взрослого организма 31
1.2.6. Перспективы использования МСК 32
1.3. Молекулярные и клеточные механизмы ответа на гипертермию 33
1.3.1. Стресс 33
1.3.2. Клеточный стресс 34
1.3.3. Семейство белков теплового шока (HSP) 35
1.3.3.1. Малые белки теплового шока 37
1.3.3.2. Белки семейства Hsp60 39
1.3.3.3. Белки семейства Hsp70 39
1.3.3.4. Белки семейства Hsp90 44
1.3.4. Транскрипционная регуляция экспрессии HSP 44
1.3.5. Активация сигнальных каскадов при температурном воздействии 46
1.3.6. Изменения клеточных структур после воздействия гипертермии 46
1.3.6.1. Воздействие гипертермии на клеточную мембрану 47
1.3.6.2. Воздействие гипертермии на цитоскелет 48
1.3.6.3. Воздействие гипертермии на цитоплазму и клеточные органоиды 49
1.3.7. Влияние гипертермии на клеточный цикл 49
1.3.8. Влияние гипертермии на репарацию ДНК 51
1.3.9. Гипертермия вызывает клеточную гибель 51
2. Материалы и методы исследований 53
2.1. Клеточные культуры, использованные в работе 53
2.2. Получение чЭСК 53
2.3. Культивирование чЭСК С910 54
2.4. Криоконсервация и размораживание чЭСК 54
2.5. Получение и культивирование чЭСК–ДИФ 54
2.6. Получение и культивирование эМСК 55
2.7. Криоконсервация и размораживание эМСК 56
2.8. Построение кривых клеточного роста 56
2.9. Температурная обработка клеток 56
2.10. Проточная цитофотометрия 56
2.10.1. Иммунофенотипический анализ 56
2.10.2. Анализ клеточного цикла 57
2.11. Анализ апоптоза 57
2.12. Кариотипирование 57
2.13. Иммуноцитохимия 58
2.14. Определение активности щелочной фосфатазы 59
2.15. Направленная адипогенная, остеогенная и нейральная дифференцировка 59
2.15.1. Адипогенная дифференцировка 59
2.15.2. Остеогенная дифференцировка 60
2.15.3. Нейральная дифференцировка 60
2.16. Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга 60
2.16.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения белков 60
2.16.2. Электрофорез и иммуноблоттинг 61
2.17. Анализ генной экспрессии с помощью ОТ-ПЦР 62
2.18. Статистическая обработка результатов 64
3. Результаты 65
3.1. Клеточные линии, использованные в работе 65
3.1.1. Характеристика клеточной линии чЭСК С910 65
3.1.2. Характеристика фибробластоподобных клеток (чЭСК-ДИФ) 67
3.1.3. Характеристика МСК человека, полученных из десквамированного эндометрия менструальной крови (эМСК) 67
3.2. Влияние ТШ на чЭСК и их дифференцированные производные чЭСК-ДИФ 71
3.2.1. Экспрессия белков теплового шока в чЭСК С910 и чЭСК-ДИФ 71
3.2.2. Тепловой шок индуцирует апоптоз в чЭСК, но не в их дифференцированных производных 73
3.2.3. Сублетальный ТШ (45 oC, 30 мин) вызывает стресс-индуцированное преждевременное старение (SIPS) в чЭСК-ДИФ 74
3.3. Свойства плюрипотентных чЭСК и их дифференцированных производных,
переживших сублетальный ТШ 77
3.3.1. Свойства чЭСК С910, переживших сублетальный ТШ 77
3.3.2. Дифференцированные производные чЭСК, пережившие сублетальный ТШ, сохраняют свойства исходных клеток 77
3.4. Влияние ТШ на СК взрослого организма (эМСК) 79
3.4.1. Тепловой шок не индуцирует апоптоз в эМСК 79
3.4.2. ТШ индуцирует SIPS в эМСК 81
3.4.3. Экспрессия белков теплового шока в эМСК 81
3.4.4. Свойства эМСК, переживших сублетальное воздействие температуры 84
4. Обсуждение 87
5. Заключение 101
6. Выводы 102
Список цитируемой литературы
