Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Биологически активные свойства резвератрола 11
1.2. Основные источники резвератрола 17
1.3. Биосинтез резвератрола и его производных 19
1.4. Классические биотехнологические приемы увеличения продукции резвератрола в культуре клеток винограда 23
1.5. Участие ионов Сa2+ в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK) 27
1.6. Характеристика семейства CDPK винограда 31
1.7. Типы альтернативного сплайсинга растений 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1. Клеточные линии и компоненты питательных сред 43
2.2. Обработка блокатором потенциал-зависимых мембранных Ca2+-каналов, специфическим ингибитором CаМ-подобных протеинкиназ и ионофором Ca2+ А23187 44
2.3. Выделение нуклеиновых кислот и получение комплементарной ДНК 44
2.4. Количественная оценка экспрессии генов STS 45
2.5. Количественная оценка экспрессии эдногенных генов VaCDPK в нетрансгенных клетках винограда 46
2.6. Получение полной последовательности генов VaCDPK1a, VaCDPK1e, VaCDPK1d, VaCDPK2a, VaCDPK3c и VaCDPK3a 49
2.7. Получение трансгенных клеточных линий V. amurensis, сверхэкспрессирующих гены VaCDPK, c помощью агробактериальной трансформации 51
2.8. Проверка трансгенности полученных клеточных линий винограда 52
2.9. Определение содержания стильбенов в образцах ткани V. amurensis 55
2.10. Получение рекомбинантных белков и анализ их протеинкиназной активности 55
2.11. Статистическая обработка полученных результатов 56
ГЛАВА 3. Результаты 57
3.1. Влияние верапамила на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в клеточных линиях V. amurensis 57
3.2. Влияние специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в культуре клеток V. amurensis с повышенной продукцией резвератрола 6 1
3.3. Влияние ионофора Са2+ на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в клеточных линиях V. amurensis 66
3.4. Характеристики VaCDPK-трансгенных клеточных линий винограда 72
3.4.1. VaCDPK1a-трансгенные клеточные линии винограда 75
3.4.2. VaCDPK3a-трансгенные клеточные линии винограда 78
3.4.3. VaCDPK1d-трансгенные клеточные линии винограда 85
3.4.4. VaCDPK2а-трансгенные клеточные линии винограда 88
3.4.5. VaCDPK1е-трансгенные клеточные линии винограда 91
3.4.6. VaCDPK3с-трансгенные клеточные линии винограда 100
3.5. Протеинкиназная активность полноразмерного белка VaCDPK3a и его
укороченных вариантов 105
ГЛАВА 4. Обсуждение 109
Выводы 116
Список литературы
