Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1.Нитратредуктаза, ее структура и функции 10
1.2. Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в растениях 12
1.2.1. Регуляция нитратредуктазы нитратом 14
1.2.2. Регуляция цитокинином 23
1.2.3. Регуляция HP светом 29
1.2.3.1. Участие фитохрома в регуляции HP 30
1.2.3.2. Влияние фотоассимилятов на активность HP 32
1.2.3.3. Регуляция HP на посттрансляционном уровне 33
1.2.4. Регуляция HP продуктами ассимиляции нитрата 37
1.3. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды 42
1.3.1. Действие избыточного засоления на процесс восстановления нитрата 45
1.3.2. Действие Cd на процесс восстановления нитрата 49
1.3.3 Действие теплового шока на активность HP 51
Глава 2. Объект и методы исследования 53
2.1 Объект исследования 53
2.2. Методика постановки экспериментов 54
2.3. Определение активности HP в зародышах куколя 55
2.4. Выделение тотальной РНК 56
2.5. Оценка относительного уровня мРНК HP методом Нозерн-гибридизации 59
2.5.1. Денатурация РНК 59
2.5.2. Электрофорез денатурированной тотальной РНК 60
2.5.3. Перенос РНК с агарозного геля на мембрану 60
2.5.4. Получение Э2Р-меченого ДНК-зонда 61
2.5.5. Подготовка нейлоновой мембраны с РНК 62
2.6. Оценка относительного уровня мРНК HP методом обратной транскрипций-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 63
2.6.1 Очистка тотальной РНК от примесей ДНК 63
2.6.2. Получение кДНК 65
2.6.3. Проведение полимеразной цепной реакции 65
2.6.4. Оценка результатов ПЦР 67
2.7. Создание конструкции для оверэкспрессии фрагмента гена HP в E.coli и очистка этого белка 68
2.7.1. Выделение тотальной ДНК из зародышей куколя 68
2.7.2. Получение фрагмента гена Agnr2 69
2.7.3. Получение плазмиды pQE30 71
со встроенным в нее фрагментом гена Agnr2 71
2.7.4. Лигирование плазмиды pQE30 с фрагментом гена Agnr2 72
2.7.5. Приготовление компетентных клеток штамма E.coli М15 72
2.7.6. Трансформация бактерий E.coli плазмидой pQE30 с фрагментом гена HP куколя 74
2.7.7. Проверка экспрессии фрагмента гена Agnr2 куколя и синтеза кодируемого им белка в E.coli 75
2.7.8. Очистка рекомбинантного белка HP от других белков E.coli 76
2.7.9. Перенос белка из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану 79
Глава 3. Результаты и их обсуждение 80
3,1. Индукция активности HP нитратом и цитокинином 82
3.2 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК HP 84
3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP зародышей куколя в ответ на
действие нитрата и цитокинина 87
3.3.1. Основы метода ОТ-ПЦР, используемого для оценки транскриптов индивидуальных генов 87
3.3.2 Подбор праймеров для ОТ-ПЦР 89
3.3.2.1 Подбор праймеров для индивидуальных генов HP 89
3.3.2.2. Подбор праймеров для контрольного гена 94
3.3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP 97
3.4. Влияние NaCl на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов 102
3.5. Влияние С(ЗС1г на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов 105
3.6. Влияние теплового шока на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов 107
3.7 Создание конструкции для синтеза фрагмента белка HP куколя в E.coli и очистка этого белка 110
Выводы 121
Слисок используемой литературы 123
Приложения 140
