Введение
1.1 Актуальность проблемы 6
1.2 Цели и задачи исследования 7
1.3 Основные положения, выносимые на защиту 7
1.4 Научная новизна , 8
1.5 Научное и практическое значение работы 9
2 Обзор литературы 10
2.1 Открытие и структура витамина Д 10
2.2 Метаболизм и транспорт витамина Д 11
2.3 Молекулярные механизмы действия кальцитриола 14
2.3.1 Регуляция экспрессии генов 14
2.3.2 "Быстрое" негеномное действие кальцитриола 20
2.4 Биологические функции витамина Д 20
2.5 Предстательная железа как орган-мишень кальцитриола 23
2.5.1 Эпидемиологические исследования 23
2.5.2 Метаболизм витамина Д и экспрессия гена VDR в предстательной железе 25
2.5.3 Действие кальцитриола на клетки рака предстательной железы 26
2.5.3.1 Подавление пролиферации 26
2.5.3.2 Индукция дифференцировки 27
2.5.3.3 Индукция апоптоза 28
2.5.3.4 Подавление ангиогенеза и инвазии клеток 28
2.5.4 Взаимодействие между сигнальными системами кальцитриола и андрогенов 29
2.6 Сунерсемейство факторов роста TGF-p и рак предстательной железы 32
2.7 Суперсемейство факторов роста PDGF/VEGF и рак предстательной железы 42
2.8 Заключение 46
3 Материалы и методы. 48
3.1 Препараты, приготовление растворов 48
3.2 Методы клеточной биологии 48
3.2.1 Культивирование клеток 48
3.2.2 Обработка клеток гормонами и факторами роста 49
3.2.3 Анализ скорости роста клеток 50
3.2.3.1 Метод окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым (Kueng, 1989) 50
3.2.3.2 Оценка количества жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего (Tennant, 1964) 51
3.2.4 Анализ адгезивных свойств клеток (Monboisse, 1991) 51
3.3 Методы анализа нуклеиновых кислот 51
3.3.1 Выделение РНК 51
3.3.2 Электрофорез РНК (Masek, 2005) 52
3.3.3 Скрининг генов на микрочипах кДНК 53
3.3.3.1 Получение меченой кДНК 53
3.3.3.2 Гибридизация кДНК с микрочипами 53
3.3.3.3 Обработка данных 54
3.3.4 Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени54
3.3.5 Анализ стабильности РНК (Leclerc, 2002) 56
3.4 Методы белковой химии 57
3.4.1 Выделение белков из культуры клеток 57
3.4.2 Аналитический электрофорез белков в присутствии SDS (Laemmli, 1970) 57
3.5 Высокоэффективная жидкостная хроматография 58
4 Результаты. 60
4.1 Скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках рака предстательной железы человека линии LNCaP 60
4.2 Индукция экспрессии гена плацентарного трансформирующего фактора роста-р (PTGF-Р) кальцитриолом 64
4.2.1 Кальцитриол индуцирует экспрессию гена PTGF-Р в клетках LNCaP 64
4.2.2 Действие пифитрина-а на содержание мРНК PTGF-р в клетках LNCaP, инкубированных с кальцитриолом 71
4.2.3 Действие PTGF-p на клетки LNCaP. Его регуляция кальцитриолом 72
4.2.3.1 Рекомбинантный PTGF-p подавляет рост клеток LNCaP 72
4.2.3.2 Рекомбинантный PTGF-p не влияет на адгезию клеток LNCaP к белкам базальной мембраны 73
4.2.3.3 Рекомбинантный PTGF-p индуцирует фосфорилирование киназ, регулируемых внеклеточными сигналами (ERK1 и ERK2) 74
4.2.3.4 Антитела к PTGF-p частично восстанавливают рост клеток LNCaP, инкубированных с кальцитриолом 75
4.2.4 Взаимодействие между кальцитриолом и 5а-дигидротестостероном (DHT) в регуляции
экспрессии reHaPTGF-P 77
4.3 Подавление экспрессии гена р-рецептора тромбоцитарного фактора роста
(PDGFRP) под действием кальцитриола 83
4.3.1 Экспрессия генов рецепторов PDGF в клетках эпителия и стромы предстательной железы человека 83
4.3.2 Кальцитриол подавляет экспрессию гена PDGFRp в клетках предстательной железы линий LNCaPHP29SN 88
4.3.3 PDGF-BB усиливает рост клеток LNCaP в присутствии EGF 91
5 Обсуждение результатов 94
5.1 Скрининг генов, регулируемых кальцитриолом в клетках LNCaP 94
5.2 Индукция экспрессии гена PTGF-Р кальцитриолом 94
5.3 Взаимодействие между кальцитриолом и DHT в регуляции экспрессии гена PTGF-p 100
5.4 Подавление экспрессии гена PDGFRp кальцитриолом 101
6 Выводы. 104
7 Благодарности 105
8 Список литературы. 106
