Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Структура и каталитический механизм пероксидаз растений 7
2 1 1 Классификация гем-содержащих пероксидаз и реакционный цикл 7
2 1.2 Структура пероксидаз и механизм расщепления пероксида водорода 9
2.1.3. Структурные и каталитические особенности нативной пероксидазы табака 14
2.1.4. Проблема субстратной специфичности пероксидаз 18
2 1.4.1. Субстрат-связывающий центр лигнинпероксидазы 19
2.1.4 2 Субстрат-связывающие центры пероксидазы хрена 22
2.1.5. Роль кальция в структуре и активности пероксидаз 27
2.1.6. Инактивация пероксидазы пероксидом водорода 28
2 2. Методы получения рекомбинантных пероксидаз 31
2.2 1. Экспрессия в растениях 31
2.2.2. Экспрессия в дрожжах и грибах 32
2.2.3. Экспрессия в Е coll 32
2 3. Механизм окисления люминола под действием пероксидаз 34
3 Экспериментальная часть 37
3.1. Материалы 37
3.2. Методы исследования 37
3 2.1. Клонирование гена пероксидазы табака 37
3.2.2. Направленный мутагенез пероксидазы табака 38
3.2.3. Экспрессия пероксидазы табака в клетках Е coh 38
3.2.4. Выделение пероксидазы табака 3 8
3.2.5. Рефолдинг пероксидазы табака 38 3 2 6 Очистка пероксидазы табака 39
3.2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез) 39
3.2.8. Определение молекулярной массы пероксидаз 40
3 2.9 Спектрофотометрическое определение активности пероксидаз 40
3.2.10. Расчет констант скорости по данным стационарной кинетики 42
3.2.11. Совместное окисление фенола и резорцина 42
3.2.12. Совместное окисление 23НМ и 34НМ 42
3 2 13. Радиоинактивация пероксидаз 42 3.2.14. Определение концентрации пероксида водорода в ходе радиолиза 43
3.2.14. Реакция окисления люминола 43
4. Результаты и их обсуждение 44
4.1. Рефолдинг рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа 44
4 1.1. Оптимизация экспрессии и рефолдинга по активности 44
4 1.2 Наработка препаративных количеств фермента дикого типа 47
4 1.3. Особенности кристаллической структуры пероксидазы табака 51
4.2. Получение мутанта рекомбинантной пероксидазы табака GluUlPhe 57
4.2.1. Сравнение выходов при рефолдинге ферментов дикого типа и мутанта 57
4.2.2. Очистка рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа и мутанта 58
4.3. Сравнение свойств ферментов дикого типа и мутанта 67
4.3.1. Субстратная специфичность 67
4.3.2. Влияние катионов кальция на окисление ABTS
и электрохимические свойства 69
4.3.3. Стабильность водных растворов ферментов в условиях радиолиза 78
4.3.4. Люминесцентные свойства ферментов 87
4.4. Механизм совместного окисления фенолов и ABTS под действием пероксидазы табака 97
4.4.1. Окисление фенола и резорцина 97
4.4.2. Окисление 23НМ и 34НМ 109
5. Выводы 118
6. Список литературы
