Введение
I. Обзор литературы 10
1. Проблема злокачественных новообразований и способы их лечения 10
Проблема злокачественных новообразований 10
Способы лечения раковых заболеваний 11
2. Лекарства адресного действия 12
Принцип адресной доставки лекарств 12
Использование антител в качестве молекул-носителей для адресной доставки лекарств 14
Использование белков, связывающихся с раковыми клетками, в качестве молекул-носителей для адресной доставки лекарств 15
3. Альфа-фетопротеин человека - его строение и функциональные свойства 18
Введение 18
Строение алъфа-фетопротеина человека 19
Функциональные свойства алъфа-фетопротеина человека 27
4. Ренатурация рекомбинантных белков 37
Причины агрегации рекомбинантных белков при экспрессии в
бактериальной системе 37
Общие представления о ходе сворачивания белковой молекулы 39
Общие представления о процессе ренатурации белков 41
5. Основные методы ренатурации рекомбинантных белков 43
Ренатурация методом разбавления 43
Ренатурация методом пульс-разбавления 43
Ренатурация методом диализа 44
Основные параметры условий ренатурации 44
6. Ренатурация белков, иммобилизованных на твердом носителе 45
П. Материалы и методы 51
1. Препаративные методы 51
Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерный АФП 51
Создание генно-инженерных конструкций для экспрессии вариантов С- концевого домена АФП 51
Продукция rAFP3D595 и rAFP3D609 55
Выделение и очистка ТВ, содержащих целевой белок, из клеток Е. coli... 56 Выделение и очистка rAFP3D595 и rAFP3D609 в денатурирующих условиях 57
2. Ренатурация rAFP3D595 и rAFP3D609 57
Ренатурация очищенного на Ni-смоле белка методом быстрого разбавления 57
Ренатурация очищенного белка методом диализа 58
Ренатурация белка, иммобилизованного на кремниевой металло-хелатной смоле 58
3. Аналитические методы 59
Масс-спектрометрия 59
Анализ АТ-концевой последовательности аминокислот белка 59
Определение свободных сулъфгидрилъных групп 59
Аналитическая хроматография 59
Круговой дихроизм (КД) 60
SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 60
Определение концентрации белка 61
4. Исследование функциональных свойств rAFP3D595 и rAFP3D609 61
Конъюгирование rAFP3D595/rAFP3D609 с флуоресцентной метой 61
Клеточные линии 62
Анализ связывания и эндоцитоза rAFP3D595/rAFP3D6O9-0HTIJ в опухолевых клетках и лимфоцитах 62
Микроскопия 62
Конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином 63
Анализ цитотоксической активности конъюгата rAFP3D с цитостатиком в опухолевых клетках и лимфоцитах 63
III. Результаты и обсуждение 65
1. Клонирование и экспрессия вариантов С-концевого домена АФП 65
Экспрессия с помощью ИПТГ 68
Автоиндукция 69
2. Выделение и очистка ТВ 72
3. Ренатурация фрагментов С-концевого домена АФП 73
Ренатурация методом разбавления 74
Ренатурация методом диализа 75
Ренатурация фрагментов АФП на твердой фазе 76
Сравнениеренатурации методом разбавления и с помощью ІМАС 80
4. Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП 83
Подтверждение идентичности полученного целевого белка методом масс-спектрометрии 83
Анализ N-концевой последовательности фрагмента А ФП 84
Хроматографический анализ олигомерного состояния белка 84
Определение числа сулъфгидрилъных групп с помощью реактива Эллмана 88
Анализ вторичной структуры ренатурированных фрагментов методом КД 88
5. Анализ функционально свойств рекомбинантных фрагментов АФП 90
Распределение флуоресцентно меченных фрагментов АФП в экспериментах in vitro 90
Химическое конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином 93
Цитотоксическая активность конъюгата rAFP3D609-Cipro 96
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы 102
